基于大规模磷酸化蛋白质组学的黏着斑激酶（FAK）位点特异性磷酸化调控景观与共调控网络整合分析

《International Journal of Molecular Sciences》：An Integrative Phosphoregulatory Landscape of FAK Signaling

　　

黏着斑激酶（FAK）是一种蛋白酪氨酸激酶，在调控细胞黏附、增殖、运动和存活中发挥主要作用。尽管FAK调控性磷酸化位点（phosphosites）在癌症进展和转移中具有重要作用，但其磷酸化的整体图景仍很大程度上未知。因此，绘制磷酸化调控网络可为靶向治疗提供重要见解。为表征FAK的磷酸化，研究人员系统检索了PubMed收录的研究，并汇编了大规模基于细胞质谱（MS）的磷酸化蛋白质组学数据集。研究人员对678个定性数据集和235个定量细胞磷酸化蛋白质组学数据集进行了整合性、数据驱动分析，以绘制FAK磷酸化特征。研究观察到S910修饰是催化性激酶结构域外最常检测到的磷酸化。这提示S910在信号传导中的调控作用比先前认识更广泛。进一步，通过整合不同生物学背景下的磷酸化位点共检测模式，研究人员表征了FAK磷酸化及其共调控的其他蛋白磷酸化位点（PsOPs）。对S910与FAK激活磷酸化位点Y576、Y577和Y861的磷酸化共调控分析提供了不同的潜在磷酸化位点交叉对话。此外，研究预测了若干潜在候选底物和互作PsOPs，为未来实验研究优先排序磷酸化位点提供框架。而且，研究还展示了一个胃泌素（gastrin）相关信号中潜在FAK磷酸化位点特异性共调控关联的假设模型。总之，这些大规模观察结果为未来以FAK为中心的实验方法以及理解其作为潜在靶点的多层面作用提供了数据驱动基础。

主体部分解读：

研究背景与意义：FAK（黏着斑激酶）亦称蛋白酪氨酸激酶2（PTK2），是非受体蛋白酪氨酸激酶，位于染色体8q24.3，分子量约125 kDa、长1052个氨基酸，含N端FERM（four-point-one-ezrin-radixin-moesin）结构域、中央激酶结构域和C端FAT（focal adhesion targeting，黏着斑靶向）结构域。FAK通过整合素和生长因子受体信号调控细胞黏附、增殖、迁移和存活；Y397自磷酸化、Y576/Y577激活环磷酸化及Y861/Y925等参与FAK-Src复合物和下游信号。FAK在肿瘤中常过表达并促进生长、存活、侵袭和转移，是潜在治疗靶点。但FAK位点特异性磷酸化调控模型仍不完整，许多位点功能不清，且不同位点与其他磷酸蛋白的共调控及互连激酶网络尚待系统研究。为此，研究人员整合大规模磷酸化蛋白质组数据，以磷酸化位点共检测和共差异调控为基础，系统表征FAK相关磷酸化网络，为靶向治疗和后续实验优先排序提供依据。

研究方法概述：研究人员系统检索PubMed，仅纳入人类细胞系来源的质谱（MS）磷酸化蛋白质组学研究，排除鼠、植物等物种及人组织样本；汇编119篇文献的678个定性数据集和56篇文献的235个定量差异数据集。FAK磷酸化位点按Class I标准（定位概率≥75%或A-score>13）纳入并映射UniProt/HUGO。定性数据统计检测频率；定量数据以p<0.05且倍数变化≥1.3/≤0.76判定上/下调。以共差异表达分析鉴定PsOPs（Phosphosites in Other Proteins，其他蛋白中的磷酸化位点），采用Fisher精确检验（FET）与错误发现率（FDR），并用实验条件码和PMID置信度≥3过滤。整合PhosphoSitePlus、Phospho.ELM、RegPhos 2.0、iKiP-DB、Johnson et al. (2023)预测及HPRD、BIND、BioGRID、ConsensusPathDB、CORUM、RegPhos互作数据。

研究结果：

2.1 人类细胞FAK全局磷酸化蛋白质组数据资源：通过PubMed检索和人工筛选，汇编913个报告Class-1 FAK磷酸化位点的人类细胞数据集（678个定性、235个定量差异，分别来自119和56篇文献），将位点和蛋白映射至UniProt与基因符号，并按数据集中检测频率排序。

2.2 FAK中频繁检测的磷酸化修饰：频率分析显示S910为激酶结构域外最常检测位点（定性402、定量111），Y576/Y577（295/168；35/26），Y861/Y397（153/141；22/17），提示S910可能具有超越经典酪氨酸磷酸化的调控作用。

2.3 FAK位点共现模式：在同时检测多个FAK位点的定量差异数据集中分析正/负共现，Y576与Y577强正共现，S910与T914正共现，提示激活环协调磷酸化及T914潜在调控。

2.4 FAK磷酸化相关PsOPs：对S910、Y576、Y577、Y861进行共调控分析（FET、FDR、10%阈值），分别鉴定正/负共调控PsOPs 471/3、28/23、3/12、16/3；如S910与IRS2等，Y576与PXN Y118等正、CTNND1 Y96等负，Y577与NEDD9 Y166等正、AHNAK等负，Y861与BCAR1等正、FRS2等负；强调为统计关联而非因果。

2.5 S910共调控PsOPs的功能背景：PhosphoSitePlus注释显示相关位点参与细胞周期、生长、细胞骨架组织、运动及癌变，为S910功能研究提供候选。

2.6 共调控的实验验证与预测FAK底物：整合PhosphoSitePlus、Phospho.ELM、RegPhos 2.0、iKiP-DB及Johnson et al. (2023)预测，以FDR<0.05鉴定11个与Y576/Y577/Y861共调控的候选，其中PTK2 Y577、PXN Y118、PTK2 Y576有实验证据，PKP3 Y176、AHNAK Y1469、PIK3R2 Y605、GIT1 Y545、DOCK1 Y1811、IRS2 Y675、BCAR1 Y38、BCAR3 Y117为预测候选；多与黏附和细胞骨架相关。

2.7 FAK互作蛋白磷酸化位点共调控：在全局数据中鉴定46个FAK互作PsOPs与FAK位点显著共调控，包括PTPN1、EGFR、APC、EPHA2、CTTN、NCK1、PXN、VCL、NEDD9、ACTN4、CDK5、LCK、BCAR1、DOCK1等，GO（基因本体）富集于黏附和运动；LCK Y394与Y576正相关，BCAR1 Y128/GIT1 Y545与Y861正相关，CTTN Y446、PAK2 T169、PAK1 T212、EGFR S695/T693、DEF6 S597与S910正相关；提示候选但需CoIP（免疫共沉淀）、定点突变和靶向磷酸化蛋白质组验证。

2.8 FAK与胃泌素信号网络的潜在共调控PsOPs：对FDR<0.05的PsOPs进行通路富集，胃泌素信号显著，涉及PTK2、PXN、BCAR1、TJP1、SLC9A1、EGFR、PAK1、PIK3R2、RAF1、ELK1、MEF2D；基于既往胃泌素网络映射19个PsOPs，构建假设模型；因数据非胃泌素刺激，不能解释为胃泌素依赖调控。

讨论部分总结：S910高频检测不应解释为磷酸化丰度增加；既往实验显示ERK磷酸化S910可形成PIN1停靠位点，招募PTP-PEST使Y397去磷酸化，抑制FAK催化并增加黏着斑周转，促进癌细胞迁移和转移；心肌细胞中内皮素-1经PKCδ和Src诱导S910磷酸化，S910A突变稳定FAK-paxillin相互作用、减少paxillin周转并损害细胞铺展和肌节重组，扩张型心肌病患者心肌中S910和ERK5表达降低。胃泌素信号富集为FAK相关PsOPs提供生物学背景：胃泌素经胆囊收缩素B受体（CCKBR/CCK2R）介导，FAK可作为其下游信号转导子，既往报道p⁶⁰Src/p¹²⁵FAK复合物位于PI3K通路上游；SLC9A1、TJP1、EGFR、PAK1、ELK1、RAF1、MEF2D、PXN、BCAR1等与胃癌相关，支持优先研究这些PsOPs，但现有数据非胃泌素刺激，仅属假设生成。许多共调控PsOPs缺乏位点特异性功能注释，可能代表未识别的FAK相关信号组分。局限包括公共数据选择偏倚、质谱平台/富集/样本/分析异质性、检测频率不等同于丰度或功能重要性、未能统一归一化和批次校正、PMID和实验条件置信度非正式独立性校正；共调控是统计关联，不能证明因果或直接激酶-底物关系，需靶向敲低/敲除、定点突变和体外激酶实验验证。

研究结论翻译：本研究通过整合大规模定性和定量磷酸化蛋白质组数据集，提供了以磷酸化位点为中心的FAK相关信号视图，使研究人员能够系统表征FAK磷酸化及其相关共调控网络。FAK S910在汇编的磷酸化蛋白质组数据集和多样实验背景中频繁检测到，表明该位点被反复观察，并支持进一步研究其潜在调控作用。对S910、Y576、Y577和Y861的位点特异性共调控分析鉴定了与细胞黏附、迁移、细胞骨架重塑、细胞周期调控、细胞内定位和癌症相关信号过程相关的共调控磷酸化网络。整合实验验证和预测底物、蛋白-蛋白相互作用和磷酸化位点注释进一步支持这些网络的生物学背景，并鉴定出许多先前未表征的PsOPs作为FAK相关信号的候选组分。FAK相关共调控PsOPs与胃泌素信号网络的观察重叠进一步提供了假设生成框架，用于研究FAK相关磷酸化调控与胃泌素相关信号在胃肠癌及相关疾病中的潜在交叉。总体而言，本研究提供了研究位点特异性FAK信号的系统层面框架，并为机制研究、底物验证和功能研究优先排序候选磷酸化位点提供了资源。更广泛地说，这些发现证明以磷酸化位点为中心的网络分析可用于识别传统蛋白水平分析可能忽略的先前未识别候选信号关系，从而促进对癌症中激酶相关磷酸化调控的更详细理解。