计算血清抗氧化能力掩盖尿酸与非结合胆红素对白细胞计数的相反关联：一项纳入25(OH)D的十年医院实验室横断面研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Calculated Serum Antioxidant Capacity Masks Opposite Associations of Urate and Unconjugated Bilirubin with Leukocyte Count: A Ten-Year Cross-Sectional Hospital Laboratory Study Including 25-Hydroxyvitamin D

　　

计算总抗氧化能力（calculated total antioxidant capacity, cTAC）是白蛋白、尿酸和胆红素的加权和，常被解释为单一抗氧化维度。研究人员探讨其各组成部分是否与白细胞计数——一种炎症性、产氧化剂细胞区室的常规但非特异性标志物——具有相同关联，并考察25-羟基维生素D [25-hydroxyvitamin D, 25(OH)D]。在这项对一家三级大学医院实验室常规记录（2014–2023年；20,525患者年，14,152名成人）的回顾性横断面研究中，cTAC采用Trolox当量系数计算（0.63·白蛋白 + 1.02·尿酸 + 1.50·胆红素）。对数白细胞计数、白细胞减少（<4×10⁹/L）和白细胞增多（≥10×10⁹/L）的患者聚类模型校正年龄、性别、季节和时期，并进一步校正估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate, eGFR）和丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）。尿酸占cTAC方差的90%。cTAC与白细胞增多呈U形关联，而其各组成部分的关联方向相反。每标准差，尿酸与白细胞更多相关（+4.2%，95% CI 3.2–5.2；白细胞增多比值比[odds ratio, OR] 1.23，1.14–1.32），计算非结合胆红素与白细胞更少相关（?4.3%，?5.7至?2.9；OR 0.71，0.63–0.82）。对缺失协变量进行多重插补后，两种关联相似。校正血小板使胆红素估计值减弱至?1.4%，而校正血红蛋白无此影响；在血小板计数150–400×10⁹/L且无贫血时，为?3.8%（?5.0至?2.7）。25(OH)D呈弱负相关（?1.2%，?1.8至?0.6），无效应修饰证据。在该横断面背景中，残余混杂可能存在，单一计算抗氧化能力在统计学上掩盖了其组成部分与白细胞计数方向相反的关联。

研究背景与问题：氧化应激（oxidative stress）指氧化剂生成与抗氧化防御失衡并向氧化剂倾斜，导致氧化还原信号紊乱和分子损伤。由于单个活性物种短寿命且临床样本难以定量，实验室医学长期依赖对抗氧化侧的整合指标。Trolox当量抗氧化能力（Trolox-equivalent antioxidant capacity, TEAC）检测由Miller、Rice-Evans等建立，对内源性血浆抗氧化剂排序，白蛋白和尿酸贡献大部分活性，胆红素等贡献较小；铁还原能力（ferric-reducing ability of plasma, FRAP）也把最大份额归于尿酸。测量总抗氧化能力（total antioxidant capacity, TAC）及由成分计算的指数已用于许多临床场景，但TAC是检测依赖的复合值，当成分因非氧化还原原因变化时解释含糊。本文中cTAC指由常规分析物计算的指数，并非抗氧化能力测量。三个主要内源性成分的生物学远超自由基清除：尿酸在细胞外清除过氧自由基和单线态氧，但细胞内可促氧化促炎，其由黄嘌呤氧化还原酶生成的过程产生超氧和过氧化氢，单钠尿酸盐晶体激活NLRP3炎症小体，损伤细胞释放的尿酸作为内源性危险信号；血清尿酸与白细胞计数等炎症标志物相关，并受肾功能强决定。非结合胆红素（unconjugated bilirubin）是血红素降解终产物，生理浓度下为亲脂性链断裂抗氧化剂，血红素加氧酶-1（haem oxygenase-1, HO-1）轴广泛抗炎，胆红素抑制白细胞迁移和NADPH氧化酶活性，轻度升高与较低炎症负担和心血管风险相关，并与成人白细胞计数和C反应蛋白负相关。白蛋白是负急性期蛋白，炎症时下降；25(OH)D调节抗氧化和免疫基因程序。白细胞计数是全身炎症的常规、非特异但具预后信息的标志物，活化中性粒细胞和单核细胞是循环活性氧和氯物种主要来源。若cTAC捕捉单一保护性抗氧化维度，则复合值及各成分应与较低白细胞计数同向相关；若成分携带不同、部分促炎信号，复合指数会平均相反关联并掩盖之。既往研究多分别考察尿酸或胆红素与炎症标志物，或将测量TAC作为单一暴露，尚未见研究相反关联在计算指数内如何组合；复合氧化平衡评分在流行病学中日益常用，使该问题具方法学意义。研究人员因此用十年常规实验室数据分解cTAC，比较复合与成分同白细胞计数、白细胞减少和白细胞增多的关联，并对比计算非结合胆红素与直接胆红素，同时考察25(OH)D的关联及效应修饰。

关键技术方法：研究基于斯洛文尼亚卢布尔雅那大学医学中心临床化学与生物化学研究所2014—2023年常规实验室匿名记录，纳入同次请求检测25(OH)D、白细胞计数、白蛋白、尿酸、总胆红素和直接胆红素的18—100岁成人，按每患者每年首条记录构建患者年队列。采用Trolox当量系数计算cTAC，并以FRAP权重、未加权摩尔和及系数±50%作替代。主要用患者聚类稳健标准误的对数白细胞线性模型及白细胞减少/增多logistic模型，校正年龄B样条、性别、季节、时期，并进一步校正eGFR和ALT；采用B样条检验非线性、多重插补处理缺失ALT、E值和多组敏感性分析。

研究结果：
2.1 研究人群：从107,900条25(OH)D请求记录筛选，最终20,525患者年（14,152人）具完整基础协变量；中位年龄63.0岁，56.7%为女性，中位25(OH)D 59 nmol/L，中位白细胞计数7.0×10⁹/L，白细胞减少占3.8%、白细胞增多占12.4%；白细胞减少者白蛋白、尿酸和血红蛋白较低而非结合胆红素较高，白细胞增多者尿酸较高而非结合胆红素较低。
2.2 计算抗氧化能力的组成：中位cTAC为786 μmol/L Trolox当量；白蛋白贡献中位417 μmol/L（52.5%水平），尿酸354 μmol/L（45.2%），胆红素15 μmol/L（1.9%）；但尿酸占cTAC方差90.5%，白蛋白7.1%，胆红素2.4%；替代权重下尿酸占63–97%方差，各指数仍与白细胞计数正相关；25(OH)D与白蛋白和非结合胆红素正相关、与尿酸负相关，与复合值接近零相关。
2.3 复合指数与白细胞计数：每标准差cTAC与白细胞计数高2.9%相关，白细胞减少OR 0.74，白细胞增多OR 1.07；按cTAC五分位，白细胞增多患病率为15.2%、10.6%、10.0%、12.0%和14.2%，呈U形；以尿酸替代cTAC的模型差异更大（+3.6%每标准差）且解释略多。
2.4 分解：尿酸与非结合胆红素方向分离：同时纳入各成分时，尿酸与较高白细胞计数相关（+3.5%每标准差；白细胞增多OR 1.19，白细胞减少OR 0.85），计算非结合胆红素与较低白细胞计数相关（?4.6%；白细胞增多OR 0.71，白细胞减少OR 1.19）；白蛋白与白细胞减少（OR 0.60）和白细胞增多（OR 0.84）均负相关；直接胆红素无清晰关联。进一步校正eGFR和ALT后，尿酸+4.2%每标准差、白细胞增多OR 1.23，非结合胆红素?4.3%、OR 0.71；临床单位对应每100 μmol/L尿酸+3.4%、每5 μmol/L非结合胆红素?2.8%；B样条显示cTAC与白细胞增多U形，尿酸高于约300 μmol/L时预测白细胞增多增加，非结合胆红素在显示范围内总体降低；模型仅解释对数白细胞计数变异的较小部分。
2.5 缺失协变量数据：无ALT者更老、eGFR较低、尿酸较高且多来自2020年前；无ALT模型和多重插补后估计相似或略强，插补后尿酸+4.3%每标准差、白细胞增多OR 1.25，非结合胆红素?4.9%、OR 0.67。
2.6 血液学、肝脏和营养协变量：校正血红蛋白不减弱非结合胆红素估计（?4.7%），校正血小板使其减弱至?1.4%，联合校正为?1.8%；在血小板150–400×10⁹/L且无贫血的9094患者年中，非结合胆红素估计为?3.8%，白细胞增多OR 0.76，白细胞减少关联不清晰；排除贫血不减弱；校正平均红细胞体积、红细胞分布宽度、γ-谷氨酰转移酶、碱性磷酸酶、总蛋白和葡萄糖不改变尿酸或胆红素估计；白蛋白在校正血红蛋白或血小板后变号，说明其方向依赖校正集。
2.7 25-羟基维生素D：模型D中25(OH)D与白细胞计数弱负相关（?1.2%每标准差），白细胞增多OR 0.93，白细胞减少无清晰关联（OR 1.06）；各模型均见负相关；无证据表明25(OH)D修饰复合值、尿酸或非结合胆红素与白细胞计数的关联，置信区间排除大交互但不排除小交互。
2.8 敏感性分析：各敏感性分析中尿酸与非结合胆红素保持相反关联；一患者一记录、排除白细胞≥30×10⁹/L、eGFR<30 mL/min/1.73 m²、白蛋白<35 g/L或总胆红素>34 μmol/L、男女分开及2020年前后分析中，尿酸每标准差估计+2.6%至+5.5%，非结合胆红素?2.4%至?5.5%；单患者年与重复患者年相似；按患者年数加权、日历年固定效应、年内标准化及年龄样条不改变估计；限制直接胆红素>2或>3 μmol/L使胆红素估计减弱至?3.2%或?2.6%。

讨论部分总结：讨论指出，这些均为横断面关联，不能推断因果，残余混杂可能存在。尿酸与白细胞计数正相关与人群研究一致，方向不能由横断面确定，原文列出至少三种相容解释：白细胞生成和周转增加可升高尿酸；尿酸可能参与炎症，包括黄嘌呤氧化还原酶生成超氧和过氧化氢、细胞内尿酸促氧化及单钠尿酸盐晶体激活NLRP3炎症小体、促进中性粒细胞募集，实验模型中可溶性尿酸也可启动细胞因子产生并激活NLRP3；尿酸与白细胞可能共享未测量决定因素，如肥胖、代谢综合征、肾清除降低、利尿剂或急性疾病。该关联在校正eGFR、排除eGFR<30、校正血液学/肝脏/营养协变量后持续，是最一致发现；这种“血浆抗氧化但关联产氧化和促炎通路”的双重化学，是尿酸主导指数不能读作抗氧化保护测量的主要原因。非结合胆红素与白细胞计数负相关与实验所示胆红素抑制白细胞黏附、跨内皮迁移和NADPH氧化酶相符，也与HO-1/胆绿素还原酶通路抗炎及轻度高胆红素者炎症标志物较低相关；Tsai et al.报告成人总胆红素与白细胞计数负相关。本文分别分析计算非结合胆红素和测量直接胆红素，并将胆红素置于复合抗氧化指数中。血液学分析显示该关联对血小板校正敏感：血红蛋白校正和排除贫血不减弱，血小板校正减弱，提示与共享血液学决定因素、相关标志物或校正相关偏倚相一致；血小板计数可为炎症共标志，其作为混杂、中介或碰撞变量取决于本研究不能建立的因果 relationship。在血小板150–400×10⁹/L且无贫血亚组，非结合胆红素与白细胞计数和白细胞增多的负关联持续，但与白细胞减少关联不清晰；限制不能去除残余混杂。孤立非结合高胆红素血症的Gilbert样表型探索比较未显示白细胞计数差异，但样本少且不精确。计算非结合胆红素为总胆红素减直接胆红素，直接胆红素检测也检测白蛋白结合的结合胆红素，故计算值为间接胆红素估计而非非结合胆红素分析测量；胆红素以整数μmol/L报告，36.8%直接胆红素≤2 μmol/L，低值处分辨率和检测不精密度影响大；测量误差方向和幅度不能确定；限制直接胆红素>2或>3 μmol/L减弱但未消除关联，且改变样本构成。白蛋白与白细胞减少和增多均负相关，呈非特异健康状态标志模式；其与白细胞计数的小正关联在校正血红蛋白或血小板后逆转，方向依赖校正集；白蛋白供cTAC水平过半但仅占方差7%，cTAC跨患者年基本表现为转化后的尿酸浓度（r=0.92），故复合值对单一抗氧化剂与炎症白细胞区室的关联说明有限。25(OH)D与白细胞计数弱负相关，生物学意义不确定，不能读作维生素D降低全身炎症的证据；无统计交互证据，但“无证据”不等于“无效应”，置信区间排除大交互但不排除小交互，不支持维生素D与内源性抗氧化剂协同作用于白细胞区室的假设。方法学意义在于：TAC及相关复合指数因白蛋白和尿酸主导，整合了负急性期蛋白、具促炎关联的嘌呤代谢物和具抗炎特性的血红素衍生分子；本数据中这些成分与白细胞计数方向不同，复合可掩盖成分相反关联；cTAC与白细胞增多的U形可能反映不同成分关联、病例构成和残余混杂，其来源未确定，未建立临床可用阈值，不认为U形是临床有意义发现。效应量不大，一个标准差尿酸或非结合胆红素约对应0.3×10⁹/L白细胞，主要模型解释对数白细胞计数变异不足5%；未评估患者层面炎症预测，不建立临床预测效用或验证新生物标志物。贡献是方法学：复合抗氧化指数可掩盖其成分相反方向关联，本研究结局中cTAC在可比模型中对对数白细胞计数变异的解释略少于尿酸单独；建议作为待检验假设，报告测量TAC或计算cTAC及相关抗氧化间隙的研究也应报告白蛋白、尿酸和胆红素并分别分析，是否在测量TAC、其他炎症标志物如C反应蛋白及其他人群出现同样掩盖需检验。优势包括患者年数量大、所有指数分析物和白细胞计数同一实验室请求、患者聚类推断、使用已发表TEAC系数和替代权重、计算非结合与直接胆红素对比及广泛敏感性分析。局限包括横断面观察设计不能推断因果且残余混杂可能存在；提取数据无诊断、合并症、吸烟、药物、C反应蛋白或白细胞分类，总白细胞计数不能区分中性粒细胞变化与其他白细胞群，是非特异全身炎症代理且不测产氧化；白细胞减少和增多用固定阈值定义，不识别临床原因；校正eGFR、ALT等不能去除未测疾病混杂；E值约1.5（尿酸）和1.6（非结合胆红素），即与暴露和白细胞增多风险比达此大小的未测混杂可解释点估计，医院人群中感染、恶性肿瘤或急性疾病可能产生此强度混杂；治疗可能多方向影响关联，黄嘌呤氧化酶抑制剂降低尿酸和氧化应激、利尿剂升尿酸、糖皮质激素升中性粒细胞、细胞毒化疗降白细胞而细胞溶解升尿酸，药物类别净影响不可预测，需含治疗类别信息的前瞻研究；队列为维生素D和广泛化学面板共同请求的医院和门诊选择流，患者较老且更常患病，关联尤其U形可能在健康人群不同；多年检测患者贡献多个患者年，检测次数可能反映疾病严重度，但单次与重复患者年及一患者一记录分析估计相似；cTAC是计算代理而非测量能力，TEAC系数来自纯化合物单一检测，可能不适用于血浆、疾病或其他检测，抗坏血酸、生育酚和非白蛋白硫醇不可得，但主要结论不依赖系数；不能定量低浓度胆红素测量误差或重建历史检测变化，直接胆红素误差传播至计算非结合分数；日历年校正和年内标准化处理系统漂移但不处理精密度变化；ALT约三分之一缺失且主要在2020年前，多重插补结果相似但依赖缺失仅取决于观测变量的假设，插补模型忽略患者内患者年聚类。姊妹分析共享实验室基础设施和时期但研究25(OH)D与血清尿酸，本文以白细胞计数为结局并分解复合抗氧化指数，无结果重复。

研究结论（译）：计算血清抗氧化能力在水平上由白蛋白和尿酸主导，在变异上由尿酸主导；在该医院人群中，其对对数白细胞计数变异的解释略少于尿酸单独。其成分与白细胞计数的关联方向相反：尿酸呈正向且一致，计算非结合胆红素呈负向。非结合胆红素估计在校正血小板后减弱，并在血小板计数150–400×10⁹/L且无贫血的亚组中持续存在。25(OH)D显示小的负相关，无效应修饰证据。这些横断面关联不能确定尿酸促进炎症或胆红素保护免受炎症；然而，它们表明单一复合抗氧化值可能掩盖其成分与炎症细胞区室标志物之间的相反关联。因此，抗氧化能力研究应同时报告和解释复合指标及其成分，该建议下一步应以测量的抗氧化能力和特异性炎症标志物进行检验。