吡啶区域异构与芳基取代调控异烟肼衍生缩氨基硫脲的发散环化反应：基于DFT的机理分析与抗分枝杆菌活性评价

《International Journal of Molecular Sciences》：Pyridine Regioisomerism and Aryl Substitution Govern the Divergent Cyclization of Isoniazid-Derived Thiosemicarbazides: Mechanistic DFT Analysis and Antimycobacterial Evaluation

　　

摘要：异烟肼（isoniazid, INH）是一种成熟的抗结核药效团，被广泛用作开发潜在抗结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）化合物的结构平台。本研究将异烟肼衍生的缩氨基硫脲作为前体，用于合成噻唑烷-4-酮（thiazolidin-4-one）衍生物，重点探讨了吡啶区域异构和芳基取代对环化结果的影响。研究人员合成了含有2-、3-或4-吡啶基团以及氟代或氯代苯基的缩氨基硫脲，并将其与溴乙酸乙酯进行环化反应。采用密度泛函理论（density functional theory, DFT）计算比较了生成噻唑烷-4-酮和1,3,4-噁二唑（1,3,4-oxadiazole）的竞争路径，并对所得杂环化合物针对四种Mtb菌株进行了评估。一项使用2-吡啶基/2-氟苯基缩氨基硫脲的初始对照实验得到了目标产物噻唑烷-4-酮。然而，对更广泛底物系列的研究揭示了显著的底物依赖性环化选择性差异。大多数底物生成了1,3,4-噁二唑，而带有邻位氟或邻位氯取代基的2-吡啶基缩氨基硫脲则选择性地形成了噻唑烷-4-酮。DFT计算为观察到的环化路径分歧提供了能量学上的解释。尽管进行了系统的结构多样化改造，但所有研究的1,3,4-噁二唑和噻唑烷-4-酮衍生物，包括含酯官能团的类似物，均未表现出明显的抗分枝杆菌活性（最低抑菌浓度≥512 μg/mL）。这些发现表明，吡啶区域异构与芳基取代的组合强烈影响了异烟肼衍生缩氨基硫脲的环化路径。然而，控制环化的显著结构-反应性关系并未转化为针对结核分枝杆菌的有意义的结构-活性关系。实验与计算结果相结合，为控制环化选择性的因素提供了见解，并为未来设计新的INH衍生类似物提供了指导。

论文解读：吡啶区域异构与芳基取代调控异烟肼衍生缩氨基硫脲的发散环化反应

研究背景与科学问题

结核病（tuberculosis, TB）主要由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起，尽管已有有效的抗菌疗法，但耐药菌株的出现使治疗复杂化，亟需新型抗分枝杆菌药物。异烟肼（isoniazid, INH）是一线抗结核治疗的关键组分，其结构修饰被广泛探索以开发新药。缩氨基硫脲是重要的合成中间体，可转化为多种具有生物活性的杂环骨架，其中噻唑烷-4-酮（thiazolidin-4-one）衍生物因其广泛的抗结核潜力而备受关注。然而，缩氨基硫脲与α-卤代乙酸酯的反应并非必然生成噻唑烷-4-酮，也可能通过竞争路径生成1,3,4-噁二唑（1,3,4-oxadiazole）。因此，阐明决定环化路径选择性的结构因素对于合成控制和理解分子结构如何影响反应选择性至关重要。本研究旨在系统探究吡啶区域异构（2-, 3-, 4-吡啶基）和芳基取代（不同位置的氟、氯）对INH衍生缩氨基硫脲与溴乙酸乙酯环化行为的影响，并结合密度泛函理论（density functional theory, DFT）计算揭示其机理，同时评估所得产物的抗分枝杆菌活性。

研究方法与技术

研究人员采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   有机合成：通过吡啶甲酰肼与相应取代苯基异硫氰酸酯反应，制备了18种含有不同吡啶区域异构体和氟/氯取代苯基的缩氨基硫脲前体。随后，在优化条件下（无水乙酸钠催化，无水乙醇回流）将其与溴乙酸乙酯进行环化反应。此外，还通过另一条合成路线——缩氨基硫脲与丁炔二酸二甲酯（dimethyl acetylenedicarboxylate, DMAD）在甲醇中回流反应，制备了第二系列的C5-酯官能团化的噻唑烷-4-酮衍生物。
2. 2.
   密度泛函理论计算：选用代表性底物，在ωB97x-D/def2-SVP理论水平下，结合连续溶剂化模型（乙醇），对噻唑烷-4-酮和1,3,4-噁二唑形成的竞争路径进行能量分析，特别关注质子转移、闭环及构象重排等关键步骤。
3. 3.
   抗分枝杆菌活性评价：采用肉汤微量稀释法，参照临床实验室标准化协会标准，测定了所有合成化合物对标准株H₃₇Rv、敏感临床分离株192、耐多药菌株36/26（耐异烟肼和利福平）及单耐异烟肼菌株3715的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）。

研究结果

2.1. 研究设计、优化及环化产物分布

研究人员首先以2-吡啶基/2-氟苯基缩氨基硫脲为对照底物，优化了环化条件。在最优条件下（无水乙酸钠，无水乙醇回流），该底物顺利生成目标噻唑烷-4-酮。然而，将该条件应用于全部18种底物后，发现了显著的底物依赖性发散：绝大多数底物（包括所有3-和4-吡啶基衍生物以及大部分2-吡啶基衍生物）生成了1,3,4-噁二唑；唯独同时含有2-吡啶基和邻位氟或邻位氯取代苯基的两种底物选择性地生成了噻唑烷-4-酮。这表明环化选择性取决于吡啶区域异构和芳基取代模式的特定组合。

2.2. DFT对环化路径的探究

2.2.1. 计算模型与构象分析：对酯官能团化的代表性底物进行了力场构象分析和DFT优化，获得了稳定的初始结构。

2.2.2. 噻唑烷-4-酮形成的DFT分析：计算表明，无催化和单分子乙醇辅助的直接闭环能垒过高（>40 kcal/mol），无法实现。而乙酸根阴离子催化的两步机制（去质子化后闭环）能垒显著降低至约12 kcal/mol，且两个对比底物的能垒相近，表明闭环步骤本身不能解释选择性的差异。

2.2.3. 1,3,4-噁二唑形成的DFT分析：该路径同样需要乙酸根协助的去质子化，随后进行闭环。两个底物的闭环能垒也较为接近（约30 kcal/mol）。

2.2.4. 噁二唑环化前的构象旋转：研究发现，形成1,3,4-噁二唑的前提是C(=O)-N-N=C片段从优势的反式构型转变为顺式构型。对于去质子化的中间体，2-吡啶基/邻氯苯基底物的反式到顺式旋转能垒为8.8 kcal/mol，而3-吡啶基/邻氯苯基底物仅为3.1 kcal/mol。这是计算中发现的最显著的底物依赖性差异，与3-吡啶基衍生物更容易生成噁二唑的实验结果定性相符。

2.3. 选定酯官能团化噻唑烷-4-酮衍生物的合成

研究人员通过另一条合成路线成功制备了8种C5-酯官能团化的噻唑烷-4-酮衍生物，产率良好，结构经核磁共振波谱确认。

2.4. 抗分枝杆菌活性

对所有合成的化合物（包括1,3,4-噁二唑、初始环化得到的噻唑烷-4-酮以及酯官能团化的噻唑烷-4-酮）进行抗Mtb活性测试。结果显示，所有化合物对所有测试菌株的MIC值均≥512 μg/mL，未表现出有意义的抗分枝杆菌活性。

讨论与结论

讨论：实验结果表明，紧密相关的缩氨基硫脲前体在相同条件下可遵循不同的环化路径，这种发散性尤其体现在2-和3-吡啶基衍生物上。DFT计算排除了直接闭环的可能性，证实了乙酸根催化的必要性。关键的底物选择性差异来源于形成1,3,4-噁二唑所需的构象重排步骤：3-吡啶基底物的反-顺旋转能垒远低于2-吡啶基底物，这与其更易生成噁二唑的趋势一致。计算模型虽提供定性机理解释，但仍受限于连续溶剂模型的近似性。尽管前人研究表明相关前体具有活性，但本研究中所有杂环产物均无活性，说明结构-反应性与结构-活性性在此系列中是脱钩的。

结论翻译：本研究展示了异烟肼衍生缩氨基硫脲在环化反应中存在显著的底物依赖性发散。在相同反应条件下，吡啶区域异构和芳基取代模式的微小变化足以决定反应生成噻唑烷-4-酮还是1,3,4-噁二唑衍生物。特别是，2-吡啶基与邻位氟或邻位氯取代基的组合始终有利于生成目标噻唑烷-4-酮骨架，而大多数其他取代模式则主要导致噁二唑的形成。因此，实验结果在该系列中建立了一个清晰且可重复的结构-反应性关系。DFT计算表明，乙酸根辅助的质子转移是使环化路径在能量上可行的必要条件，并且两个对比底物的内在闭环能垒差异很小。主要的底物依赖性特征是去质子化的3-吡啶基中间体的反-顺旋转能垒显著较低，这一定性上与其更大的生成1,3,4-噁二唑的趋势一致。相比之下，生物学评价未显示相应的结构-活性关系。无论是主要的噁二唑系列还是初始环化研究中获得的噻唑烷-4-酮衍生物，对所测试的Mtb菌株均未显示出明显活性。同样，在第二个独立制备的噻唑烷-4-酮系列中引入额外的酯取代基也未提高抗分枝杆菌效力。这些发现突显了结构-反应性与结构-活性关系之间的重要区别，后者可能具有很强的骨架依赖性。尽管所研究的化合物未能成为有效的抗分枝杆菌候选物，但这些阴性结果从药物化学角度界定了当前化学空间的局限性，并表明在这些特定的噻唑烷-4-酮和噁二唑骨架内进行进一步优化不太可能直接获得改善的抗分枝杆菌活性。同时，在环化反应中观察到的显著且可重复的底物控制为未来将合成工作导向替代结构基序奠定了基础。总的来说，本研究的主要贡献在于识别并通过机理阐释了一个清晰的底物控制的两种竞争性杂环化路径的发散现象，并证明了这种强烈的化学结构-反应性关系并未伴随着针对Mtb的相应结构-活性关系。