花旗松素通过削弱细菌致病力增强临床相关细菌的抗菌疗效

《International Journal of Molecular Sciences》：Taxifolin Attenuates Bacterial Pathogenicity and Thereby Enhances Antibacterial Efficacy in Clinically Relevant Bacteria

　　

摘要专业翻译 生物膜形成是促进细菌毒力、持久性及降低抗菌治疗敏感性的重要致病过程。因此，本研究评估了花旗松素（taxifolin）作为潜在抗生物膜药物的作用。研究人员检测了花旗松素对生物膜形成、浮游生长、抗生素敏感性以及生物膜和毒力相关基因表达的影响。花旗松素可抑制粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、变形链球菌（Streptococcus mutans）、远缘链球菌（Streptococcus sobrinus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、痤疮皮肤杆菌（Cutibacterium acnes）和牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）的生物膜形成（半数抑制浓度IC50为0.065~0.79 μg/mL）。在10 μg/mL浓度下，花旗松素对粪肠球菌和屎肠球菌的浮游生长无显著影响。花旗松素增强了市售抗生素的抗菌活性，并下调了与细胞溶素相关的基因（cylR、cylM和cylLs）、群体感应基因（fsrB和fsrC）、生物膜相关基因（gelE、acm、scm、ebpA、ebpB和bps）以及生物膜相关毒力基因Esp的表达。花旗松素抑制生物膜形成、增强细菌敏感性并减弱毒力相关基因表达，支持其作为辅助抗生物膜疗法用于管理生物膜相关细菌感染的潜力。仍需进一步研究以明确其作用机制、对已形成生物膜的活性、药理学特性、安全性及在适当体内模型中的疗效。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

细菌生物膜是细菌黏附于生物或非生物表面后，通过自身分泌的胞外聚合物（EPS）基质包裹而形成的结构化微生物群落。生物膜的形成过程通常包括初始附着、不可逆黏附、成熟和分散等多个阶段。在此过程中，细菌会发生显著的生理和转录变化，从而增强其在恶劣环境中的存活能力。生物膜基质不仅提供机械稳定性，还能限制抗菌药物的渗透，同时营养和氧气梯度会形成代谢异质性的细菌群体，导致其对抗生素的敏感性降低。因此，生物膜相关感染往往难以根除，即使经过常规抗菌治疗仍可能持续存在。

黏附于宿主组织是促进生物膜形成的关键起始步骤，进而促进细菌的致病性、定植、免疫逃逸和慢性感染的建立。生物膜内的细菌可逃避宿主免疫机制，并耐受对浮游菌有效的抗生素浓度。此外，生物膜内的细菌还可能对抗菌治疗表现出降低的敏感性，且生物膜相关环境可能促进与抗菌药物耐药性相关的遗传物质交换。因此，抑制生物膜形成的早期阶段是预防细菌定植和提高现有抗生素疗效的重要策略。粪肠球菌和屎肠球菌是医院感染的重要病原菌，其生物膜形成能力与多种毒力因子和群体感应系统密切相关，且常携带多种耐药决定簇，包括影响糖肽类和β-内酰胺类敏感性的决定簇。然而，生物膜形成与抗菌药物耐药性是相关但不同的表型，因此生物膜抑制应被视为补充策略而非替代常规药敏试验或耐药监测。

天然黄酮类化合物因其能够干扰细菌黏附、群体感应、毒力相关通路、EPS产生和细胞包膜完整性，已成为潜在抗生物膜药物的重要来源。花旗松素（taxifolin），又称二氢槲皮素（dihydroquercetin），是一种天然存在的黄烷酮醇类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗生物膜活性。然而，其抗生物膜作用机制在不同细菌种类间可能存在差异，且尚未完全阐明。尽管黄酮类化合物具有巨大的治疗潜力，但其作为抗生物膜药物的临床转化常受限于对其精确作用机制认识不足，以及缺乏与常规抗生素在多种多重耐药病原菌中的联合疗效综合评估。因此，本研究旨在阐明花旗松素的广谱抗生物膜活性及其协同潜力，为设计更有效、更具针对性的抗生物膜感染策略提供基础性见解。

二、研究内容与主要结论

研究人员系统评估了花旗松素对九种临床相关细菌（包括革兰氏阳性和阴性病原菌）生物膜形成的抑制作用，并进一步探讨了其对肠球菌抗生素敏感性的增强效应及对生物膜和毒力相关基因表达的影响。研究结果表明，花旗松素在极低浓度下即可广谱抑制多种细菌的生物膜形成，且其作用并非通过抑制细菌生长实现，而是通过转录抑制生物膜形成、群体感应和毒力相关基因的表达来削弱细菌致病力。花旗松素还能显著增强常规抗生素对粪肠球菌和屎肠球菌生物膜的抗菌活性，即使在万古霉素耐药菌株中也表现出明显的增敏效应。这些发现支持花旗松素作为辅助抗生物膜药物用于改善持续性细菌感染治疗的潜力。

三、主要关键技术方法

本研究使用了以下关键技术方法：采用96孔微量培养板结晶紫染色法评估花旗松素对不同细菌生物膜形成的抑制作用，计算半数抑制浓度（IC₅₀）；采用平板计数法（CFU计数）评估花旗松素与氨苄西林、万古霉素和土霉素联用对预形成肠球菌生物膜的抗菌活性；通过测定OD₆₀₀绘制72小时生长曲线，验证花旗松素对浮游细菌生长无显著影响；采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测花旗松素处理后肠球菌中生物膜形成、群体感应和毒力相关基因的转录水平变化。本研究所用菌株包括万古霉素耐药粪肠球菌临床分离株（CCARM 5511）和屎肠球菌标准参考菌株（KACC 11954）。

四、研究结果

4.1 花旗松素抑制多种细菌的生物膜形成

研究人员通过结晶紫染色法评估了花旗松素对九种细菌生物膜形成的影响。结果显示，花旗松素对所有受试菌种均表现出剂量依赖性的生物膜形成抑制作用，半数抑制浓度（IC₅₀）范围为0.065至0.79 μg/mL。其中，花旗松素对肠球菌属表现出最强的抑制活性，对屎肠球菌的IC₅₀为0.065 μg/mL，对粪肠球菌为0.081 μg/mL。其他菌种的IC₅₀分别为：金黄色葡萄球菌0.099 μg/mL、变形链球菌0.11 μg/mL、远缘链球菌0.18 μg/mL、铜绿假单胞菌0.34 μg/mL、牙龈卟啉单胞菌0.41 μg/mL、大肠埃希菌0.63 μg/mL、痤疮皮肤杆菌0.79 μg/mL。鉴于花旗松素对肠球菌的优越疗效及其临床重要性，研究人员选用万古霉素耐药粪肠球菌（CCARM 5511）和标准参考屎肠球菌（KACC 11954）进行后续机制研究。

4.2 花旗松素增强粪肠球菌和屎肠球菌的抗生素敏感性

研究人员评估了花旗松素与氨苄西林（AMP）、万古霉素（VAN）或土霉素（OXY）联用对预形成肠球菌生物膜的影响。结果显示，花旗松素显著增强了所有受试抗生素对万古霉素耐药粪肠球菌和标准屎肠球菌菌株的抗菌活性。在粪肠球菌中，0.39 μg/mL花旗松素与氨苄西林联用使活菌数降至24.59%，而氨苄西林单用为39.6%；与土霉素联用使活菌数降至19.0%，而单用为24.0%。值得注意的是，即使在万古霉素耐药粪肠球菌中，添加0.39 μg/mL花旗松素使万古霉素的杀菌效果提高了51.6%。在屎肠球菌标准株中，0.39 μg/mL花旗松素同样显著增强了氨苄西林、土霉素和万古霉素的活性。这些结果表明花旗松素能够恢复或增强抗生素对肠球菌生物膜的疗效，包括耐药菌株。

4.3 花旗松素不影响细菌生长

为排除花旗松素通过杀菌或抑菌作用间接抑制生物膜形成的可能性，研究人员使用10 μg/mL的高浓度花旗松素（超过生物膜抑制IC₅₀值100倍以上）处理粪肠球菌和屎肠球菌72小时。结果显示，即使在10 μg/mL浓度下，花旗松素也未显著影响这两种细菌的生长。这表明花旗松素的抗生物膜活性并非继发于生长抑制或杀菌作用，而是特异性地干扰生物膜形成过程。

4.4 花旗松素抑制生物膜相关和毒力基因的表达

研究人员通过qRT-PCR检测了花旗松素对粪肠球菌和屎肠球菌中生物膜发育、群体感应和毒力相关基因表达的影响。结果显示，花旗松素处理呈剂量依赖性地降低多种生物膜相关基因的转录。在粪肠球菌中，编码黏附素和生物膜基质相关组分的基因gelE、ebpB和esp显著下调；花旗松素还抑制了与肠球菌细胞溶素产生相关的基因（cylR、cylM和cylLs）的表达。在屎肠球菌中，花旗松素抑制了esp、gelE、acm、scm、ebpA、bps、fsrB和fsrC的表达。这些结果表明，花旗松素通过转录抑制生物膜基质产生、群体感应调控和毒力因子表达相关基因来抑制生物膜形成。

五、讨论与结论

讨论部分指出，生物膜相关感染仍是重大的治疗挑战。花旗松素作为抗毒力策略的优势在于，它不抑制浮游生长，从而最大限度地减少了驱动抗菌药物耐药性的选择性压力，适合作为辅助治疗药物。花旗松素对预形成成熟生物膜同样具有增敏作用，其临床价值主要在于与常规抗生素联用时破坏成熟生物膜防御，而非作为独立的清除剂。花旗松素对群体感应、黏附、定植、毒力和耐药相关基因的下调，提示其可能通过干扰特定群体感应传感器激酶或直接抑制关键表面锚定酶来发挥作用。然而，转录水平的变化并不直接证明基因产物受到抑制，未来需通过分子对接、表面等离子体共振（SPR）和靶向蛋白质组学等技术阐明其直接分子结合靶点。研究局限性包括仅评估了每个菌种的一个菌株，未来需纳入多个临床菌株以确认广谱适用性，并需开展成熟生物膜活性、抗生素相互作用定量分析、细胞毒性、药代动力学及体内模型研究。

结论部分指出，花旗松素显著抑制了多种临床相关病原菌的生物膜形成。在粪肠球菌和屎肠球菌中，10 μg/mL浓度下浮游生长未受显著影响。花旗松素还增强了常规抗生素的抗菌活性，并下调了与群体感应、黏附、生物膜发育、细胞溶素产生和细菌毒力相关的基因。这些发现表明，花旗松素可能干扰生物膜相关致病力，并可作为有前景的辅助抗生物膜药物，用于改善持续性细菌感染的治疗。然而，仍需进一步研究以阐明其物种特异性作用机制、评估其对已形成生物膜的活性、确定其安全性和药代动力学特性，并在适当的体内模型中确认其治疗疗效。