基于报告病毒的高通量筛选鉴定LM-10为靶向KRM1的新型柯萨奇病毒A10入侵抑制剂

《International Journal of Molecular Sciences》：Reporter Virus-Based High-Throughput Screening Identifies LM-10 as a Novel Inhibitor Targeting KRM1 for Coxsackievirus A10 Blockade

　　

引起手足口病的肠道病毒，包括当前流行的柯萨奇病毒A10（CVA10）和柯萨奇病毒A6（CVA6），依赖KREMEN1（KRM1）进入细胞，因此病毒–KRM1相互作用界面成为抗病毒干预的潜在靶点。研究人员筛选了GLMarNP，一个包含约3000种天然产物及其衍生物的内部化合物库。通过盲对接、类药性评估和骨架多样性分析，筛选出靶向KRM1胞外域的候选化合物。为实现高通量抗病毒筛选，研究人员将eGFP插入全长感染性CVA10 cDNA克隆中，构建了命名为eGFP-A10的报告病毒。该病毒在HEK293T细胞中成功拯救，并在RD细胞中经连续传代后产生强荧光信号。在29个候选化合物中，LM-10表现出最强的抗病毒活性且细胞毒性低。机制研究表明，LM-10与KRM1结合并在病毒生命周期早期发挥作用。分子对接提示LM-10结合KR结构域，其结合位点与VP2 EF-loop接触区域重叠。KRM1同时作为DKK1受体调控Wnt/β-catenin信号通路。在TOP-GFP报告实验及转基因斑马鱼胚胎中，LM-10对该通路无显著影响。上述发现建立了实用的CVA10报告病毒平台，并支持通过空间阻断受体界面作为潜在抗病毒策略。

一、研究背景与科学问题

手足口病（HFMD）是一种常见的儿童传染病，由多种肠道病毒引起。柯萨奇病毒A10（CVA10）已逐渐成为引起手足口病的重要病原体之一。尽管大多数CVA10感染具有自限性，但重症病例可能涉及心肺及神经系统并发症，甚至导致死亡。目前尚无针对CVA10的疫苗或抗病毒药物获批。既往抗肠道病毒药物研发主要聚焦于病毒衣壳蛋白，但临床转化受到抗病毒谱窄、安全性问题及疗效不足等限制，亟需探索替代性抗病毒策略。

靶向遗传上稳定的宿主细胞进入受体，可能通过提高病毒逃逸屏障，对共享同一受体的快速进化RNA病毒提供广谱且持久的抗病毒活性。含Kringle结构域的跨膜蛋白1（KRM1）已被鉴定为多种手足口病相关肠道病毒的关键进入受体，包括广泛流行的CVA6以及CVA2、CVA3、CVA4、CVA5、CVA8、CVA10和CVA12。KRM1胞外域包含KR、WSC和CUB结构域，其中KR和WSC结构域通过结合衣壳峡谷上方区域介导CVA10的吸附和脱壳。这一明确的病毒–受体界面为筛选靶向KRM1的抗病毒药物提供了结构基础。

然而，KRM1靶向抑制剂发现和验证受到缺乏快速、定量、可扩展的CVA10感染检测方法的制约。传统细胞病变效应（CPE）和蚀斑实验耗时且不适合高通量筛选。报告病毒为在活细胞中直接定量监测感染提供了高效替代方案。此外，由于KRM1同时作为高亲和力DKK受体调控Wnt/β-catenin信号通路，开发KRM1靶向抗病毒药物的关键考量是在抑制病毒进入的同时保留其生理信号功能。

二、研究内容与主要结论

研究人员利用内部海洋来源天然产物及其衍生物库GLMarNP（含3000余种化合物），针对KRM1胞外域进行虚拟筛选，并构建了稳定表达eGFP的CVA10报告病毒eGFP-A10用于功能筛选。该整合策略鉴定出LM-10，一种靶向KRM1的分子，可在早期阶段抑制KRM1依赖性肠道病毒感染，且未检测到对Wnt/β-catenin信号通路的干扰，也未在斑马鱼中引起发育毒性。研究建立了基于荧光的CVA10筛选平台，支持将KRM1导向的进入阻断作为针对手足口病相关肠道病毒的潜在抗病毒策略。

三、主要关键技术方法

本研究采用以下关键技术方法：基于DiffDock的盲对接虚拟筛选，针对KRM1胞外域（PDB ID: 7BZT）筛选GLMarNP化合物库；构建全长CVA10感染性cDNA克隆（GenBank登录号MT263729）并插入eGFP报告基因生成报告病毒eGFP-A10；基于eGFP-A10的荧光高通量抗病毒活性测定；微量热泳动（MST）技术测定LM-10与KRM1及其突变体（D88A、D90A）的结合亲和力；CPE实验评估对野生型肠道病毒的广谱抑制活性；时间添加实验确定药物作用阶段；斑马鱼胚胎发育毒性评估及Wnt/β-catenin信号通路报告分析（TOP-GFP报告实验和转基因斑马鱼报告系）。

四、研究结果

2.1 GLMarNP的分子性质与类药性：对GLMarNP中所有化合物计算了六项理化性质，与FDA批准药物呈现大致相似的分布。QED评分分析显示，GLMarNP中90.10%的化合物满足不超过一项Rule-of-Five违反标准，表明该化合物库占据与FDA批准药物相当的化学空间，适合作为虚拟筛选来源。

2.2 KRM1靶向化合物的虚拟筛选：通过DiffDock盲对接筛选出965个置信度高于?1的化合物，经类药性过滤后获得390个候选物。基于Morgan指纹和MACCS指纹的t-SNE分析及Butina聚类和Murcko骨架分析显示化合物具有显著的结构多样性。综合对接置信度、类药性、结构多样性和材料可得性，最终选择29个化合物进行实验评估。

2.3 eGFP-A10报告病毒的构建与验证：在CVA10基因组五个候选位点插入eGFP报告基因，其中VP4 N末端插入构建体（eGFP-A10）产生最强荧光信号。转染后48小时收集的病毒上清产生稳健感染。感染后约9小时可检测到GFP荧光，24小时显著增强。连续传代P1至P5期间报告基因表达稳定，P7代测序未检测到插入区域氨基酸突变。病毒在4°C、?80°C储存及反复冻融条件下保持感染性。在新生小鼠中，eGFP-A10相比亲本CVA10致死性显著降低，但仍诱导可检测的中和抗体滴度。

2.4 LM-10阻断KRM1依赖性肠道病毒感染：29个候选化合物均表现出中等到良好的抗病毒活性，其中9个IC₅₀值低于20 μM。LM-10对eGFP-A10的抑制活性最强，IC₅₀为4.34 μM，CC₅₀为78.04 μM，选择指数为17.98。在CPE实验中，LM-10抑制野生型CVA10和CVA6感染（IC₅₀分别为55.83 μM和12.52 μM），但对不依赖KRM1进入的CVA16无活性，呈受体依赖性抗病毒谱。MST实验证实LM-10与KRM1直接结合，解离常数（K_D）为6.76 μM。时间添加实验表明LM-10在感染早期阶段发挥作用。分子对接预测LM-10结合KRM1 KR结构域沟槽，与VP2 EF-loop接触热点区域重叠。D88A和D90A突变使LM-10结合亲和力显著降低（K_D分别增至93.71 μM和33.04 μM），进一步支持预测的结合区域。

2.5 LM-10保留Wnt/β-catenin信号功能：斑马鱼胚胎毒性实验显示，LM-10未引起明显表型或形态异常，而另一候选物GLL-8导致66.7%胚胎死亡。在Wnt3a刺激的TOP-GFP报告实验中，LM-10不影响Wnt3a诱导的报告活性或DKK1介导的抑制效应。在Wnt报告斑马鱼胚胎中，LM-10相对于DMSO对照未显著影响报告荧光强度，而阳性对照XAV-939降低荧光、BIO增加荧光并诱导无眼表型。

五、讨论与结论

大多数肠道病毒抗病毒策略靶向病毒成分，尤其是衣壳蛋白，但其有效性可能受病毒遗传变异和耐药变异株出现的影响。靶向宿主进入受体提供互补策略，可能提供更广的抗病毒覆盖和更高的耐药屏障，尤其当受体被多种病毒共享时。KRM1因其被多种手足口病相关EV-A病毒使用且介导CVA10进入过程中的吸附和脱壳而成为有吸引力的靶点。

本研究整合AI辅助盲对接与eGFP-A10筛选平台，鉴定出LM-10为KRM1依赖性肠道病毒抑制剂。机制上，LM-10直接结合KRM1并在感染早期阶段抑制病毒进入。分子对接将LM-10定位在KRM1 KR结构域沟槽内，通过空间阻断VP2 EF-loop与KRM1的结合。尽管KR和WSC结构域同时参与DKK1识别和病毒衣壳结合，LM-10未改变Wnt3a诱导的报告活性或DKK1介导的通路抑制，也未在斑马鱼中引起发育异常，支持LM-10干扰KRM1病毒接触面而保留其Wnt/β-catenin信号生理功能的观点。

本研究存在若干局限性：缺乏LM-10与病毒颗粒空间竞争的直接证据；KRM1与LM-10共结晶未获得结构，精确结合位点和作用机制尚未完全阐明；LM-10的体内治疗潜力有待验证；需进一步评估对其他KRM1相关生理功能的影响，并进行理化性质和药代动力学优化。

结论：CVA10是手足口病的主要病原体之一，目前无有效疫苗或治疗药物。靶向宿主进入受体是阻断病毒进入的有前景策略，核心挑战在于保留受体生理功能。KRM1作为循环CVA10和CVA6的受体，同时充当Wnt/β-catenin信号中的DKK受体，为研究受体靶向抗病毒策略提供了代表性模型。本研究通过基于结构的虚拟筛选和CVA10报告病毒筛选系统，鉴定出LM-10为靶向KRM1的小分子抑制剂。LM-10直接结合KRM1并选择性阻断KRM1依赖性肠道病毒感染，预测结合于KRM1 KR结构域沟槽内，与VP2 EF-loop接触热点重叠。重要的是，LM-10在体外不干扰Wnt3a诱导的报告活性或DKK1介导的抑制效应，在斑马鱼胚胎中未引起明显发育异常且不显著干扰Wnt/β-catenin报告活性，凸显其作为有前景抗病毒策略的价值。