首批准后自扩增RNA（saRNA）疫苗的技术演进、研发格局与监管科学

《International Journal of Molecular Sciences》：Self-Amplifying RNA Vaccines After the First Approvals: Technology, Development Landscape, and Regulatory Science Considerations

　　

自扩增RNA（saRNA）是一种下一代核酸疫苗平台，其通过复制子RNA（replicon RNA）的胞内扩增增强抗原表达，而不产生感染性病毒颗粒。saRNA构建体编码源自α病毒（alphavirus）的复制酶（replicase），该复制酶由非结构蛋白nsP1–nsP4（nonstructural proteins nsP1–nsP4）组成，并可在低RNA剂量下激发强健免疫应答。复制中间体可能激活RIG-I、MDA5及内体Toll样受体3/7/8（TLR3/7/8），从而贡献佐剂样活性。Kostaive（ARCT-154；zapomeran）于2023年在日本成为首个获得完整上市批准的saRNA疫苗，随后于2025年在欧盟、2026年在英国获得授权，证明该平台在临床与监管上的可行性。当前开发已从COVID-19扩展至季节性及大流行性流感、狂犬病、克里米亚–刚果出血热、尼帕病毒病及个体化癌症疫苗。然而，较长的转录本以及额外的复制酶和亚基因组启动子（subgenomic promoter）元件，使体外转录（IVT）效率、全长RNA含量、双链RNA（dsRNA）和截短RNA杂质、脂质纳米颗粒（LNP）包封及效力检测尤为重要。监管评估日益关注复制酶和抗原的正确表达、自扩增的幅度与持续时间、生物分布与持久性以及可比性。本综述综合saRNA疫苗的科学基础、开发格局、生产挑战及监管科学考量。

1. 引言
COVID-19疫情验证了mRNA疫苗技术，但传统mRNA疫苗存在较高RNA剂量、低温配送、规模化生产与原料成本等挑战，且表达短暂、需反复加强。saRNA作为复制子RNA平台，可在低RNA剂量下增强抗原表达，具剂量节省和供应可及性潜力；Kostaive（ARCT-154；zapomeran）的批准成为平台临床与监管可行性的里程碑，开发已扩展至多种传染病和肿瘤。但较长转录本和复制酶编码区带来生产、质量与非临床评价挑战。本综述围绕分子设计、自扩增机制、免疫特性、研发格局、生产质控和监管科学进行综合。

2. 自扩增RNA平台技术
2.1. 分子结构与设计原则
saRNA保留5′帽、5′未翻译区（UTR）、编码序列、3′UTR和poly(A)尾，并额外含复制酶开放阅读框（ORF）和亚基因组启动子（sgP）。复制酶多源自α病毒非结构蛋白nsP1–nsP4，结构蛋白基因被去除，设计为非感染性RNA；仍需通过降低序列同源性和表征评估重组理论风险。其转录本约7–12 kb，较长可降低全长RNA产量、增加截短RNA和dsRNA副产物并影响LNP包封与稳定性；优化纯化和制剂后可在约0.1–10 μg诱导与常规mRNA相当或更强的免疫应答。

2.2. 自扩增机制
saRNA经LNP内吞和内体逃逸进入胞质后，先翻译nsP1–nsP4多蛋白并形成复制复合体，以正链RNA为模板合成负链，再生成全长基因组RNA和亚基因组RNA；sgP驱动抗原ORF大量转录，放大抗原表达。抗原主要经主要组织相容性复合体（MHC）I类提呈促进CD8⁺ T细胞，分泌或释放抗原可经MHC II类激活CD4⁺ T细胞。复制中间体可激活MDA5、RIG-I及TLR3/7/8，诱导I型干扰素和促炎因子，形成Th1偏向，但过度干扰素可抑制翻译；需协同优化复制酶、UTR/sgP、修饰核苷、dsRNA去除和LNP。抗复制酶免疫在临床前可影响表达动力学，人体证据仍有限。

2.3. 平台变体：反式扩增RNA
反式扩增RNA（taRNA）将复制酶与抗原模块分置于两条RNA，避免单一超长转录本，提高IVT效率和设计灵活性；但两条RNA须在同一细胞共递送并保持适当比例。早期概念研究未证明共同LNP装载；截至2026年5月，taRNA主要处于临床前阶段，尚无人体授权产品。共同配制与分别配制混合策略各需验证RNA特异性包封、胞内共递送和功能性反式扩增。

2.4. 脂质纳米颗粒递送系统
临床候选多采用LNP或纳米结构脂质载体（NLC），含可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和PEG–脂质，经内吞和内体逃逸递送RNA。长saRNA尤其需控制粒径、多分散指数（PDI）、包封率、RNA完整性、残留溶剂和脂质杂质及稳定性。Kostaive采用含ATX-126的LNP，剂量为5 μg RNA。冻干可电离LNP微针阵列及冻干NLC可提高室温稳定性、减轻冷链依赖；但saRNA与常规mRNA稳定性比较有限且具制剂特异性，自扩增延长表达不等于内在抗降解。

2.5. 临床前特征
临床前研究总体支持saRNA低剂量激发强体液和细胞免疫。流感血凝素saRNA在1.25 μg可提供与80 μg mRNA相当的保护，单价和三价构建均有效；SARS-CoV-2 saRNA在0.01–10 μg诱导剂量依赖IgG、中和抗体和Th1偏向。AAHI-SC2/NLC可诱多种假病毒中和、骨髓IgG/IgA分泌细胞和Th1反应，冻干制剂室温6个月和冷藏10个月保持免疫原性。保守NP/M1构建可诱多功CD4⁺ Th1、CD8⁺细胞毒反应和异亚型保护；T细胞耗竭可削弱保护。匹配比较显示saRNA同时增强体液和细胞读数，而非选择性T细胞优势；低RNA质量并不代表无反应原性。

3. 研发格局
3.1. COVID-19疫苗
ARCT-154是首个获完整批准的saRNA疫苗，1/2/3/3b期及日本加强比较支持其安全性、免疫原性和效力；其于2023年日本、2025年欧盟、2026年英国获授权。GEMCOVAC-19采用LION/repRNA技术，2022年印度紧急使用授权，Omicron适配GEMCOVAC-OM完成2/3期并用作异源加强。COVAC1低剂量LNP-nCoVsaRNA早期血清转化低于预期，未识别后期开发。VLPCOV-02含5-甲基胞嘧啶（5mC）修饰碱基以降低先天激活，1期退热事件较少，2026年报告3和7.5 μg诱导RBD IgG、中和抗体及CD4⁺/CD8⁺ T细胞；VLPCOV-04为XBB.1.5加强候选并开展3期。

3.2. COVID-19以外的适应证
saRNA已扩展至流感、狂犬病、新兴感染和肿瘤。流感方面，Pfizer/BioNTech完成季节性流感1期，ARCT-2138完成1期并形成报告，ARCT-2304（LUNAR-H5N1）进入美国1期并获FDA快速通道。狂犬病方面，GSK的RG-SAM和Replicate的RBI-4000已开展1期，后者报告0.1–10 μg安全、免疫原性和持久性。新兴感染方面，HDT-321针对克里米亚–刚果出血热进入1期，Gennova/CEPI推进尼帕病毒病候选，AAHI-SC2/SC3在南非开展1/2期。肿瘤方面，GRANITE采用ChAd68初免加saRNA加强的个体化新抗原方案积累1/2期经验，GRT-R910等COVID T细胞表位候选亦获临床评价。

4. 挑战与未来方向
4.1. 生产与质量控制
7–12 kb长转录本增加IVT全长RNA产量下降、截短转录本、dsRNA和模板相关杂质风险；须纯化控制制造来源dsRNA和短RNA，并区别于胞内复制中间体。关键质量属性包括5′加帽效率、poly(A)长度、全长RNA比例、RNA含量与身份、残留DNA、残留酶和内毒素。分析可采用测序、电泳/色谱、dsRNA免疫检测、qPCR及duplex RT-ddPCR连锁分析；总RNA产量需与完整性正交评价。LNP成品需控制粒径、PDI、包封率、ζ电位、形态、脂质组成和杂质、残留溶剂、氧化降解及储存稳定性；微流控混合、氮磷比、可电离脂质、辅助脂质和冻干条件均需优化。Kostaive的评估显示成品效力方法需充分验证，商业化规模saRNA经验仍有限，平台可比性和生命周期管理将日益重要。

4.2. 监管科学考量
4.2.1. 一般考量
预防性saRNA疫苗一般按生物制品或疫苗监管，但自扩增功能需额外质量和非临床评价。EMA 2025年mRNA疫苗质量指南草案将saRNA纳入预防性mRNA疫苗范围，要求正确复制酶和抗原表达、表型自扩增及相关序列元件说明；WHO TRS 1039 Annex 3可提供参考。非临床应表征RNA和抗原在目标及非目标组织的持久性，生物分布评估需关注自扩增持续、分布和清除；ICH S12原则可参考，但预防性疫苗不在其正式范围。VAED/VAERD监测强度因监管机构而异。α病毒重组理论风险需通过降低同源性、构建设计和复制 competent 重组体表征管理；MHRA认为Kostaive相关重组不能理论排除但不太可能。应区分授权前重组评估与接种后主动监测，现有EMA/WHO文件未要求常规分子监测。治疗性肿瘤或蛋白替代应用可能改变分类，应早期咨询监管机构；变异更新和平台变更可结合既往知识与可比性数据，并衔接ICH Q12。

4.2.2. Kostaive（ARCT-154）评估案例研究
EMA、PMDA和MHRA评估文件披露了较详细的免疫原性、生物分布和毒理数据。ARCT-154与ARCT-021共享VEEV复制酶和LNP，spike盒差异允许数据互证。小鼠2 μg可诱抗spike抗体和受体结合抑制活性；食蟹猴两剂7.5 μg后第56天中和抗体高于ARCT-021，并覆盖Delta和Omicron BA.1。10 μg非扩增mRNA ARM3013的IgG约相当于0.2 μg ARCT-021，但非与已上市mRNA疫苗头对头。K18-hACE2小鼠保护研究中，B细胞耗竭后肺脑保护仍存，而T细胞耗竭后感染发生。生物分布显示ARCT-154基因组RNA自血浆、肺和对侧肌肉分别于第8、15、30天清除，注射部位仅25 μg组10只中1只第60天低水平可检；负链RNA和nsP1仅短暂有限分布，spike蛋白自肌肉、脾、腘淋巴结和腹股沟淋巴结分别于第15、5、30、60天清除，支持自限性扩增。兔重复给药可见注射部位肌变性炎症、皮下炎症、短暂发热和炎症相关临床病理，最高剂量33.55 μg为NOAEL；ARCT-154较ARCT-021的IL-6/CRP反应和注射部位组织病理更轻，早期ARCT-021较高dsRNA可能相关。生殖毒研究中除高剂量母体增重减少外，未见胚胎或F₁代影响。ATX-126较mRNA持久，但无不良组织病理或生育影响；遗传毒性经结构活性关系、in silico及ARCT-810资料评估为低风险。VAED/VAERD方面，EMA和MHRA认为Th1偏向未见风险增加，PMDA保留上市后监测。

4.3. 未来研究方向与展望
saRNA正扩展至肿瘤免疫治疗和蛋白替代治疗，个体化新抗原方案已显示临床可行性。技术优化需连接分子设计与产品性能：某些修饰核苷可抑制早期干扰素并增加延长表达，但N1-甲基假尿苷与α病毒复制酶不兼容，不能假定所有核苷和复制子均适用；taRNA可通过去除sgP、重设计5′UTR和定向进化提高表达与抗体应答；制剂设计试验可平衡完整性、包封、表达和细胞激活。taRNA仍需解决共递送和化学计量控制；环状RNA（circRNA）具抗外切酶和持续表达潜力，但翻译元件、生产纯化、分析标准化和翻译效率仍待解决。大流行准备方面，H5N1、克里米亚–刚果出血热和尼帕病毒病项目体现平台快速响应价值，多抗原或多变异株设计可用于广谱流感疫苗。印度GEMCOVAC和乌干达LNP-nCOV saRNA-02试验提示区域制造和可及性潜力；NLC、冻干和微针阵列可降低冷链负担。未来5–10年，变异更新可比性、流感及新兴感染临床证据、非预防性应用拓展和热稳定制剂工业化将是关键方向。

5. 结论
saRNA是可在胞内扩增抗原表达的下一代RNA平台，能在较低RNA剂量激发强免疫应答。Kostaive在日本、欧盟和英国的批准证明其技术和临床可行性；临床前与临床研究支持剂量节省和Th1偏向免疫。但长转录本、dsRNA和短RNA杂质、LNP优化、复制酶功能以及生物分布和持久性评价仍构成特有挑战。该领域需建立稳健标准化的分析方法、可扩展生产、明确的平台可比性策略，以及区分平台层面知识与产品特异性证据的监管框架。若这些要素协同推进，saRNA有望从传染病疫苗扩展至肿瘤免疫治疗和蛋白替代，并促进更公平的全球疫苗可及性。