百里香酚调控抗氧化相关信使RNA表达并促进牛次级卵泡体外发育及卵泡腔形成

《International Journal of Molecular Sciences》：Thymol Regulates the Expression of Antioxidant-Related Messenger RNAs and Improves Bovine Secondary Follicles Development and Antrum Formation In Vitro

　　

本研究考察了1、10或100 μg/mL百里香酚（thymol）对牛次级卵泡在38.5 °C、5% CO₂条件下体外培养18天的影响。培养结束后，研究人员评估了以下参数：（1）卵泡生长、卵泡腔（antrum）形成、活力和超微结构；（2）培养液中丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）和亚硝酸盐（nitrite）水平；（3）过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物还原酶6（PRDX6）、增殖细胞核抗原（PCNA）和生长分化因子9（GDF-9）的mRNA水平。结果显示，10 μg/mL百里香酚提高细胞活力、卵泡腔形成和卵泡发育。第18天，10 μg/mL百里香酚培养卵泡的培养液中亚硝酸盐水平高于单独对照培养基或含1 μg/mL百里香酚者。基因表达分析显示，10 μg/mL百里香酚提高CAT和GPX1的mRNA水平，而其他转录本表达未受影响。透射电子显微镜（TEM）显示，除对照培养基培养者出现退化迹象外，各处理组的颗粒细胞均表现为圆形细胞核、长形线粒体和稀疏胞质空泡。综上，10 μg/mL百里香酚提高CAT和GPX1的mRNA表达，刺激卵泡腔形成并保护体外牛次级卵泡的颗粒细胞。

研究背景：早期卵巢卵泡体外培养对改善牛繁殖结局及理解卵泡发生过程具有重要意义。该生物技术的成功很大程度上取决于培养条件，尤其培养基组成。体外卵泡发育可通过细胞活动标志物监测，如增殖细胞核抗原（PCNA）作为DNA聚合酶辅因子用于指示颗粒细胞（granulosa cells）增殖，生长分化因子9（GDF-9）作为卵母细胞（oocyte）分泌的旁分泌因子反映卵母细胞发育能力及卵母细胞-颗粒细胞通讯。维持细胞稳态和抵御氧化应激是体外卵泡培养的关键问题。细胞酶促系统在保护颗粒细胞和卵母细胞免受氧化损伤中居中心地位：超氧化物歧化酶（SOD）催化超氧阴离子歧化为过氧化氢和分子氧，过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）随后将过氧化氢转化为水，防止活性氧（ROS）蓄积；过氧化物还原酶6（PRDX6）通过还原过氧化氢和修复氧化膜磷脂提供额外保护。当细胞防御不能控制氧化应激时，常见细胞活力、卵母细胞质量和胚胎发育下降，因此培养基中添加抗氧化剂对减轻氧化损伤和提高体外培养体系有效性至关重要。百里香酚是百里香油中的天然单萜酚类化合物，具有酚羟基，可直接中和自由基，并可通过螯合金属离子促进内源酶促和非酶促抗氧化系统活性；近期研究显示其保护卵巢细胞免受氧化应激、增加细胞活力和功能。丙二醛（MDA）高水平与氧化应激尤其脂质过氧化相关，还原型谷胱甘肽（GSH）水平是抗氧化保护和氧化还原稳态的关键指标，一氧化氮（NO）为参与细胞功能调节的信号分子。研究人员据此假设培养基中百里香酚可改善牛次级卵泡体外发育环境，并通过增加卵泡直径和卵泡腔形成、提高细胞活力及减少氧化应激诱导损伤发挥作用。为此，研究人员评估1、10或100 μg/mL百里香酚对牛次级卵泡体外培养18天的生长、卵泡腔形成、活力、超微结构、CAT、GPX1、SOD、PRDX6、PCNA、GDF-9的mRNA表达及培养液GSH、亚硝酸盐（NO₂^?）和MDA水平的影响。结果显示10 μg/mL百里香酚提高细胞活力、卵泡腔形成和卵泡发育，第18天提高培养液亚硝酸盐水平，增加CAT和GPX1 mRNA，保护颗粒细胞超微结构；该研究提供了百里香酚在牛次级卵泡体外培养中作用的实验数据，并显示10 μg/mL处理与改善发育、卵泡腔形成及抗氧化相关转录本表达相关。

关键技术方法：卵巢采自当地屠宰场60头牛；机械分离牛次级卵泡，在38.5 °C、5% CO₂下体外培养18天，并以1、10、100 μg/mL百里香酚处理；采用形态学测量卵泡直径和卵泡腔形成，以钙黄绿素乙酰氧基甲酯（calcein-AM）/乙锭同型二聚体-1（ethidium homodimer-1）荧光评估活力，透射电子显微镜（TEM）观察超微结构，定量聚合酶链反应（qPCR）检测CAT、GPX1、SOD、PRDX6、PCNA、GDF-9的mRNA（甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）归一化，2^?ΔΔCt法），并检测培养液MDA、GSH和NO₂^?水平。

研究结果：2.1 体外培养期间的卵泡生长与活力：通过形态学和荧光活力检测，研究人员发现10或100 μg/mL百里香酚提高卵泡腔形成率；10 μg/mL还提高培养结束时生长卵泡百分比；对正常卵泡百分比无显著影响。活力检测中，10 μg/mL组calcein-AM荧光强度高于其他处理，ethidium homodimer-1荧光强度组间无差异。所有处理卵泡直径从第0天至第18天增加，但处理间卵泡生长率无差异。2.2 培养次级卵泡的超微结构特征：通过TEM观察，对照培养基卵母细胞胞质内容不清、透明带形态不规则，颗粒细胞染色质断裂且细胞器难以辨认；百里香酚处理组卵母细胞胞质连续、由完整透明带限定并可见大量卵母细胞微绒毛；颗粒细胞连接良好，圆形核和染色质保存，胞质含完整长形线粒体；与单独培养基相比未见明显不良超微结构影响。2.3 百里香酚对MDA、GSH和亚硝酸盐水平的影响：通过培养液生化检测，培养2天后100 μg/mL百里香酚组MDA高于单独对照或10 μg/mL组；第8和18天无影响，且不同培养时期MDA无差异。百里香酚和培养时期均不影响GSH。培养2天后1和10 μg/mL组亚硝酸盐高于对照；第8天无差异；第18天10 μg/mL组亚硝酸盐高于其他处理。2.4 百里香酚对mRNA表达的影响：通过qPCR检测，培养18天后10 μg/mL百里香酚组CAT和GPX1 mRNA高于对照；SOD、PRDX6、PCNA和GDF-9相对mRNA水平组间无差异。

讨论总结：作者认为百里香酚提高卵泡腔形成率和培养18天后仍处于活跃发育的卵泡百分比。卵泡生长依赖颗粒细胞代谢活动及其维持卵泡腔渐进形成的能力，这些过程对培养期间氧化还原条件敏感。既往研究显示百里香酚在牛卵巢组织培养中保存基质细胞完整性、促进原始卵泡激活并维持胶原纤维结构。卵泡腔形成由颗粒细胞代谢活动驱动的协调分泌和渗透过程，颗粒细胞产生和分泌蛋白聚糖和糖胺聚糖，包括透明质酸和perlecan，在细胞间质蓄积、产生渗透梯度并促进液体流入，水通道蛋白促进水进入。氧化应激是颗粒细胞功能障碍的原因，损害正常卵泡发育所需细胞活动；作者指出本研究未直接测定该机制，但calcein-AM荧光增强和颗粒细胞超微结构保存提供间接支持，确认机制需直接功能测定。calcein-AM荧光强度反映细胞活力和膜完整性，取决于细胞内酯酶活性，信号与卵泡内存活细胞数成比例；百里香酚的抗氧化特性可能保护颗粒细胞和卵泡膜细胞免受氧化损伤，限制结构损伤和凋亡事件，从而增强酯酶活性。第2天100 μg/mL组MDA较高，MDA为脂质过氧化和膜氧化损伤标志；亚硝酸盐为NO产生的间接标志，NO与腔前卵泡生长、卵泡腔形成和活力相关，低浓度起信号作用而过高可有害；本研究未研究一氧化氮合酶（NOS）表达或活性、NO生物利用度及相关信号通路。百里香酚增加CAT和GPX1 mRNA而不影响SOD、PRDX6、PCNA和GDF-9，提示对特定抗氧化转录本的选择性作用而非广泛转录反应；mRNA水平不一定反映蛋白丰度或活性，不能排除转录后或翻译调控，未来需蛋白水平分析。类似研究显示丁香酚（eugenol）增加GPX1而不影响CAT或PRDX6，百里香酚还增加CAT，提示对抗氧化转录谱作用相对更广；富含丁香酚和1,8-桉叶素（1,8-cineole）的Ocimum gratissimum精油增加CAT而不改变卵泡生长或形态。上述发现提示酚类和萜类化合物在该卵泡模型中选择性调节特定抗氧化转录本。作者指出未研究信号通路，CAT和GPX1上调可能与Janus激酶1/信号转导与转录激活因子3（JAK1/STAT3）通路有关，百里香酚在氧化应激人颗粒细胞中直接与JAK1相互作用并恢复SOD、CAT和GPX活性；百里香酚也有报道激活Kelch样ECH关联蛋白1/核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1（Keap1/Nrf2/HO-1）通路诱导抗氧化防御基因表达；这些通路在牛卵泡中的作用仍属推测，需进一步研究。

研究结论（译）：培养基中存在10 μg/mL百里香酚可提高卵泡腔形成、发育、活力以及CAT和GPX1的mRNA表达。此外，其有助于保存体外培养18天卵泡的卵母细胞和颗粒细胞的超微结构形态。