甘草查尔酮A经Keap1/Nrf2/HO-1通路激活减轻氧化应激与炎症并促进小鼠二度烧伤愈合

《International Journal of Molecular Sciences》：Licochalcone A Attenuates Oxidative Stress and Inflammation to Promote Second-Degree Burn Healing Through Nrf2/HO-1 Activation in Mice

　　

烧伤是全球最常见的意外创伤之一，造成显著发病率和死亡率。二度烧伤常并发细菌感染、过度炎症和氧化应激，共同阻碍创面愈合。甘草查尔酮A（LCA）是从甘草中分离的生物活性黄酮类化合物，具有抗炎和抗氧化特性，但其在烧伤创面中的治疗作用尚未被探索。在此，研究人员评估了含LCA水凝胶局部应用对小鼠背部二度烫伤模型（100 °C，5 s）创面愈合的影响，并探索相关分子变化。在体内，LCA水凝胶治疗与胶原沉积增加、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达降低、中性粒细胞和巨噬细胞浸润减少以及Ki67和血管内皮生长因子C（VEGF-C）上调相关。在过氧化氢（H₂O₂）刺激的成纤维细胞中，LCA减轻活性氧（ROS）积累，改善细胞活力和迁移，保护线粒体完整性，并恢复抗氧化酶活性。整合转录组学和蛋白质组学分析鉴定出227个共差异表达基因/蛋白，富集于活性氧通路。蛋白质印迹（Western blotting）显示，LCA的作用与核因子E2相关因子2（Nrf2）和血红素加氧酶-1（HO-1）表达增加以及Kelch样ECH相关蛋白（Keap1）表达降低相关。这些探索性发现提示，含LCA水凝胶与加速二度烧伤愈合相关，且LCA的抗氧化作用与Keap1/Nrf2/HO-1信号调控相关，支持进一步评估其作为烧伤治疗候选物的潜力。

烧伤是全球常见意外创伤，二度烧伤（second-degree burn，累及真皮的部分厚度烧伤）常伴细菌感染、过度炎症（inflammation，机体对损伤或感染的防御反应）和氧化应激（oxidative stress，活性氧蓄积超过抗氧化防御并造成损伤的状态），导致愈合延迟、瘢痕及全身并发症风险。现有银磺胺嘧啶局部抗菌但可损伤角质形成细胞和成纤维细胞并延迟再上皮化，手术植皮受供区并发症限制，水胶体等敷料价格高、需频繁更换且主要作为被动屏障，因此需要更安全有效的促愈剂。甘草查尔酮A（LCA，从甘草中分离的查尔酮类黄酮）具有抗炎、抗氧化及抗金黄色葡萄球菌（含MRSA）活性，但其促烧伤愈合作用及机制未明。研究人员因此在小鼠背部二度烫伤模型和H₂O₂刺激的L929、A9成纤维细胞（fibroblast，参与创面修复的间质细胞）中，评价局部含LCA水凝胶的作用并探索机制。结果显示LCA水凝胶与加速创面闭合、胶原沉积增加、炎症和氧化应激减轻、增殖和血管生成（angiogenesis，从原有血管形成新血管的过程）增强相关；体外LCA减轻ROS、细胞死亡并保护线粒体和迁移，恢复抗氧化酶；多组学和Western blot提示其抗氧化作用与Keap1/Nrf2/HO-1信号调控及NQO1、GPX4恢复相关。该研究将LCA药理学扩展至烧伤愈合，为局部烧伤治疗候选物提供初步依据，但属探索性。

关键技术方法：采用SPF级雌性C57BL/6J小鼠（6–8周龄，24–26 g；Sipeifu Biotechnology，北京）建立背部二度烫伤模型（100 °C，5 s），设主队列、MEBO对照队列和组学队列，局部给予含LCA水凝胶；L929和A9小鼠成纤维细胞（Procell，武汉）用于H₂O₂氧化应激模型。关键技术包括Sirius red和Masson三色染色、免疫组化、CCK-8、DCFH-DA、Calcein-AM/PI双染、Transwell、ELISA、透射电镜（TEM）、转录组测序、无标记定量蛋白质组和Western blot。

2.1 LCA促进烧伤创面胶原沉积：通过创面面积观察及Sirius red、Masson染色，LCA组创面面积小于模型组，胶原阳性面积和胶原含量高于模型组，结论为LCA促进胶原合成与沉积。
2.2 LCA抑制烧伤创面炎性细胞因子表达：通过免疫组化检测IL-1β（白细胞介素-1β）、IL-6（白细胞介素-6）、TNF-α（肿瘤坏死因子-α），LCA组三者阳性面积均低于模型组，结论为抑制局部炎症反应。
2.3 LCA减少炎性细胞浸润并增加Ki67和VEGF-C表达：通过Ly6G、F4/80、Ki67、VEGF-C免疫组化，LCA组Ly6G⁺中性粒细胞和F4/80⁺巨噬细胞浸润减少，Ki67和VEGF-C（血管内皮生长因子C）阳性表达增加，结论为抑制过度炎性浸润并促进增殖和血管生成。
2.4 LCA体外浓度选择及细胞保护：通过CCK-8（细胞计数试剂盒-8）筛选，L929用20 μM、A9用30 μM LCA，H₂O₂分别为1000 μM和1200 μM；LCA预处理提高H₂O₂损伤后细胞活力，结论为保护成纤维细胞免于氧化损伤。
2.5 LCA减少细胞内ROS积累：通过DCFH-DA（2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯）荧光，H₂O₂使绿色荧光增强，LCA预处理降低ROS（活性氧）荧光强度，结论为LCA具有ROS清除作用。
2.6 LCA减少H₂O₂诱导的细胞死亡：通过Calcein-AM/PI双染，LCA组PI阳性死亡细胞比例低于模型组、活细胞更多且形态完整，结论为LCA保护成纤维细胞免于氧化性死亡。
2.7 LCA维持成纤维细胞迁移能力：通过Transwell实验，LCA组迁移细胞数多于模型组，结论为LCA维持成纤维细胞迁移能力。
2.8 LCA恢复抗氧化酶活性并减轻氧化损伤：通过检测培养上清GSH-PX（谷胱甘肽过氧化物酶）、CAT（过氧化氢酶）和LDH（乳酸脱氢酶），LCA组GSH-PX、CAT升高、LDH释放降低，结论为LCA恢复H₂O₂清除酶活性并减轻氧化膜损伤。
2.9 LCA抑制氧化应激成纤维细胞炎性因子产生：通过ELISA（酶联免疫吸附试验）检测上清IL-1β、IL-6、TNF-α，H₂O₂刺激后升高，LCA预处理降低三者水平，结论为LCA减轻炎症反应。
2.10 LCA保护线粒体超微结构：通过TEM（透射电子显微镜）观察L929细胞，模型组线粒体结构严重破坏，LCA组线粒体基本完整、卵圆形且嵴可见，结论为LCA保护线粒体超微结构免受氧化损伤。
2.11 整合转录组和蛋白质组鉴定氧化应激相关通路：通过对第9天创面转录组和蛋白质组分析，PCA（主成分分析）显示组间分离，LCA组相对模型组有693个上调、826个下调基因，966个上调、914个下调蛋白，227个重叠分子（101上调、126下调），KEGG（京都基因与基因组百科全书）富集于化学致癌-ROS通路和MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路等，结论为LCA引起广泛转录/蛋白改变并涉及氧化应激相关通路。
2.12 LCA调控Keap1/Nrf2/HO-1抗氧化通路并恢复NQO1和GPX4表达：通过Western blot（蛋白质印迹），H₂O₂下调Nrf2（核因子E2相关因子2）、Keap1（Kelch样ECH相关蛋白1）及HO-1（血红素加氧酶-1）、NQO1（醌氧化还原酶1）、GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）；LCA恢复Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4并进一步降低Keap1，结论为LCA作用与Keap1/Nrf2/HO-1通路调控及下游靶点恢复相关。

讨论总结：讨论指出适度炎症有利清创抗感染，过度炎症放大损伤；LCA水凝胶减少促炎因子和中性粒细胞/巨噬细胞浸润，并在成纤维细胞中重现抗炎作用，与LCA抑制MAPK/NF-κB（核因子-κB）的已知作用一致。氧化应激是愈合受损关键，LCA降低ROS、恢复GSH-PX/CAT、减少LDH并保护线粒体；多组学提示ROS通路，Western blot提示Keap1降低、Nrf2/HO-1/NQO1/GPX4升高，但这些为关联性证据，未做核转位、通路抑制、铁死亡标志或敲低/回补。与银磺胺嘧啶、植皮、水胶体等比较为文献比较而非头对头。局限包括无空白水凝胶组、仅雌鼠、各时间点不同小鼠、未完全盲法、组学每组3例且原始数据未公开、单一1%剂量、体外浓度接近细胞毒范围、多重性未校正，故结论为探索性。

研究结论翻译：总之，局部应用含LCA水凝胶与加速小鼠二度烧伤创面愈合相关。体内LCA水凝胶治疗与胶原沉积增加、IL-1β、IL-6和TNF-α表达抑制、Ly6G⁺/F4/80⁺炎性细胞浸润减少以及Ki67和VEGF-C表达增强相关；体外LCA通过减少ROS积累和细胞死亡、保护线粒体超微结构和迁移能力、恢复抗氧化酶活性，保护成纤维细胞免于H₂O₂诱导的氧化损伤。整合转录组和蛋白质组分析及Western blot结果提示，这些作用与Keap1/Nrf2/HO-1信号调控相关，包括恢复下游效应分子NQO1和GPX4表达。这些探索性发现为含LCA水凝胶作为烧伤创面管理候选物提供初步证据，并支持其进一步临床前评价。