克里米亚两种稀有黄鹌属植物（Crepis purpurea 与 C. callicephala）基于质体基因组重建的系统发育分析

《International Journal of Molecular Sciences》：Phylogenetic Analysis of Rare Crepis Species of the Crimean Flora (C. purpurea (Willd.) M. Bieb. and C. callicephala Juz.) Through Plastid Genome Reconstruction

　　

摘要：菊科（Asteraceae）菊苣族（Cichorieae）中最大的属之一为黄鹌属（Crepis），包含约200个物种。众多地方类群的多样性对适应性研究具有重要意义。在黄鹌属的Lagoseris分支内，有两个稀有的近缘物种——C. callicephala Juz. 和 C. purpurea (Willd.) M. Bieb.，它们均分布于克里米亚半岛，但占据高度分化的生境。这两种生境的环境条件不同，且因地理位置和海拔而隔离，限制了配子交换的机会。这两个物种在形态上相似，但表现出不同的物候模式，是研究隔离和生境条件如何塑造遗传分化与局部适应的理想自然模型。研究人员对C. callicephala和C. purpurea的总DNA进行了测序。基于短读长和长读长数据，研究人员组装了这两个物种的质体基因组（plastid genome），并重建了黄鹌亚族（subtribe Crepidinae）的系统发育。组装的质体基因组长度分别为149,980 bp（C. callicephala）和150,007 bp（C. purpurea），两个物种在采样的黄鹌亚族中被恢复为一个位于长共有分支上的紧密近缘对。研究人员还注意到，这两个物种的研究材料共有一个位于rbcL–psaI位点的异常结构重排，影响了accD基因（编码乙酰辅酶A羧化酶的β-羧基转移酶亚基），这一现象此前在菊苣亚科（Cichorioideae）其他成员中未见报道。结合反向重复区边界的位移，这些特征为C. callicephala和C. purpurea的分类学地位及其相互关系提供了分子依据。

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一、研究背景与科学问题

菊科（Asteraceae）是真双子叶植物中最大的科，包含近1600属、24000至33000种。其中菊苣族（Cichorieae）约有1550个得到良好支持的物种，而黄鹌属（Crepis）作为该族最大的属之一，被确认的物种约200个。黄鹌属物种广泛分布于旧大陆和新大陆，跨越广阔的地理范围和多样的环境条件，其众多的局部类群多样性对于适应性研究具有重要意义。黄鹌属内部包含多个独特的进化谱系，包括狭义黄鹌属（Crepis sensu stricto）和Lagoseris谱系。在Lagoseris分支内，有两个稀有的近缘物种——C. callicephala Juz. 和 C. purpurea (Willd.) M. Bieb.，它们均分布于克里米亚半岛。前者局限于克里米亚山脉主脊前缘的岩石裂缝中，海拔1000至1500米；后者则出现在外脊和内脊山麓的钙质山坡上，海拔200至450米。尽管两者形态相似，但在植株大小、头状花序大小以及花梗和总苞片的毛被等性状上存在差异，且这些区分特征并不稳定。此外，两者在枝条发育的季节性上也存在差异：C. callicephala的枝条需经过至少两个生长季才能完成营养发育并在越冬后进入生殖期，而C. purpurea的枝条可在单个温暖季节内从营养期过渡到生殖期，并通过连续形成此类枝条实现更长的花期。这种开花物候的差异，加上地理和海拔的隔离，限制了两者之间的配子交换。因此，这两个物种成为研究隔离和生境条件如何塑造遗传分化与局部适应的理想自然模型。同时，它们的分类学地位长期存在争议，一些处理将C. callicephala归入C. purpurea的同物异名，而另一些区域植物志则将其视为独立物种。为了厘清这些问题，研究人员首先比较了二者的完整质体基因组，并基于质体组重建系统发育，以探讨它们彼此之间的关系以及在菊苣族中的系统位置。

二、研究内容与结论

研究人员对C. callicephala和C. purpurea的总DNA进行了测序，利用短读长和长读长数据组装了这两个物种的质体基因组，并在此基础上重建了黄鹌亚族（Crepidinae）乃至整个菊苣族的系统发育树。研究得出的主要结论包括：（1）成功获得了两个高质量的质体基因组序列，长度分别为149,980 bp（C. callicephala）和150,007 bp（C. purpurea），均具有典型的四分体结构；（2）在两个物种的rbcL–psaI位点发现了一个异常的结构重排，导致accD基因大部分缺失，仅残留293 bp的片段，且无法识别起始密码子，表明该基因可能发生了假基因化（pseudogenisation），这是首次在菊苣亚科（Cichorioideae）中报道此类改变；（3）反向重复区（IR）边界分析显示，两个物种的LSC/IR边界位置存在细微差异，导致rps19基因片段在IR内的长度不等（60 bp vs. 55 bp），且ndhF基因跨越了连接位点，这与其它比较物种不同；（4）系统发育分析表明，C. callicephala和C. purpurea形成一个紧密的近缘对，位于一个较长的共有分支上，二者之间的分支极短，分化度很低（约1.3×10^-4替换/位点），提示其质体谱系的分化时间较近；（5）研究中还发现，此前被提交为C. rigescens的质体基因组序列（NC_061360.1）实际上与Hypochaeris radicata几乎完全相同，并非独立的Crepis质体组，因此本研究提供的C. callicephala质体基因组可作为黄鹌属未来质体基因组研究的参考。这些结果为Lagoseris分支的分类学地位和关系提供了重要的分子数据。

三、主要关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：（1）DNA测序：对C. callicephala进行Illumina短读长测序和牛津纳米孔技术（ONT）MinION长读长测序，对C. purpurea仅进行ONT长读长测序；（2）质体基因组组装：利用GetOrganelle工具基于短读长数据进行从头组装，并采用Polypolish和POLCA进行抛光；对于长读长数据，分别采用基于参考序列的引导组装（以Lactuca sativa质体组为参考）和Canu+Flye的从头组装策略；（3）质体基因组注释与分析：使用GeSeq v2.03服务器进行自动注释，并通过Unipro UGENE进行人工核查；利用minimap2和paftools进行变异检测；通过GSAlign和BLASTN分析rbcL–psaI位点的结构重排；（4）系统发育分析：从NCBI数据库获取黄鹌亚族和菊苣族相关物种的质体基因组序列，经标准化处理后（拼接LSC、IRb和反向互补的SSC区，排除第二个IR拷贝），使用MAFFT进行多序列比对，随后采用RAxML-NG和IQ-TREE软件基于最大似然法构建系统发育树，并以Felsenstein自助法和标准非参数自助法评估分支支持率；（5）实验验证：设计特异性引物，通过PCR扩增rbcL–psaI片段和反向重复连接位点区域，并经琼脂糖凝胶电泳验证质体基因组的四分体结构和accD位点的缩短构型。样本来源：植物材料来源于2016年从克里米亚自然种群采集的种子，在尼基塔植物园（Yalta）引入无菌培养后获得的无性系。

四、研究结果

2.1 测序、质体基因组组装及变异分析

通过对C. callicephala进行8次ONT测序获得8.3 Gb长读长，4次C. purpurea测序获得6.2 Gb长读长；C. callicephala的Illumina测序获得73.4 Gb双端短读长。最终组装的质体基因组长度为149,980 bp（C. callicephala，基于短读长）和150,007 bp（C. purpurea，基于长读长）。两个质体组均注释到114个独特基因（含重复拷贝共134个），包括81个蛋白质编码基因、4个rRNA基因和29个tRNA基因。两者之间存在16个替换和34个插入缺失（indel），总计153 bp，多数位于非编码区。

2.2 影响accD位点的序列丢失

在两个物种中，accD基因仅存留293 bp的残余片段，远短于其它黄鹌亚族物种（平均约1478 bp），该残余片段不含可识别的起始密码子。通过ONT读长映射和PCR扩增实验（预期产物约1.2 kbp）验证了这一缩短构型，表明accD基因可能已假基因化。

2.3 反向重复连接位点分析

两个物种的LSC/IR边界位置存在差异，导致rps19基因片段在IR内的长度分别为60 bp和55 bp；ndhF基因跨越了连接位点，而其它比较物种的ndhF均位于SSC区内；ycf1基因向IR延伸的长度为480 bp，略多于其它物种的472 bp。

2.4 系统发育分析

基于29条质体组序列的最大似然法系统发育树显示，C. callicephala和C. purpurea形成一个支持率为100的紧密近缘对，位于一个较长的共有分支上（分支长度0.0208），二者之间的末端分支极短。值得注意的是，此前提交为C. rigescens的序列（NC_061360.1）落在所有其它黄鹌亚族物种之外，且在更大范围的菊苣族系统树中与Hypochaeris radicata聚为一支，两者几乎完全一致，表明该序列实为H. radicata的质体基因组。

五、讨论总结与研究结论

讨论部分指出，质体基因组在维管植物中高度保守，但本研究在C. callicephala和C. purpurea中发现的accD基因假基因化现象在核心菊科中并不典型。accD编码乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）的β-羧基转移酶亚基，该酶催化脂肪酸生物合成的第一步。烟草实验表明accD功能丧失会导致叶片发育缺陷、生长速率下降和种子产量减少。然而，在其它植物类群（如禾本科、风铃草科）中也观察到accD向核基因组转移或由同质型酶补偿的情况。因此，这两个Crepis物种中accD功能的实际后果尚待进一步研究。关于系统发育，研究确认了Lagoseris分支在黄鹌属中的早期分化地位，并指出了现有Crepis质体基因组数据的不足，特别是NC_061360.1序列的错误鉴定。C. callicephala和C. purpurea的质体基因组高度相似，低水平的质体分歧度（约1.3×10^-4替换/位点）和极短的末端分支提示其质体谱系近期才发生分化，但由于每个分类单元仅分析了单份材料，这些差异本身不足以界定物种，还需结合核基因组数据和更多种群样本进行综合判断。

研究结论：测序并组装的C. callicephala和C. purpurea质体基因组是Lagoseris分支内首批发表的质体组之一。完整质体组的比较为阐明黄鹌属及相关属间的相互关系带来了更多清晰认识。在两个质体组中，rbcL–psaI区间显著缩短，序列丢失影响了accD基因及相邻的非编码DNA，仅存有限的accD同源序列，不存在完整的质体accD开放阅读框，这与质体accD的假基因化相符。其对质体ACCase活性的影响仍有待解决。该模式是否存在于Lagoseris分支的其他分类群中尚不清楚。C. callicephala和C. purpurea的质体基因组显示出高度相似性，但仍存在一些差异。这些差异（包括单拷贝区和反向重复区的长度及其边界位置的差异）是否能够一致地区分这两个分类群，还有待跨种群的检验。