康复者来源广谱中和抗体DEV_K57靶向SARS-CoV-2 RBD的广谱中和机制、溶液态二聚体架构及体内抗病毒功效研究

《International Journal of Molecular Sciences》：The Broadly Neutralizing DEV_K57 Antibody, Isolated from a Convalescent Patient, in Complex with the SARS-CoV-2 RBD

　　

SARS-CoV-2的持续进化需要广谱中和抗体以提供稳健的治疗选择。本研究从一名COVID-19康复供者中分离了1824个单B细胞，并获得91对可能编码V_H/V_L结构域的核苷酸序列。研究人员从该文库中生成并评估了38株重组单克隆抗体。在该抗体组中，研究人员鉴定出DEV_K57为靶向SARS-CoV-2受体结合域（RBD）的广谱中和人IgG1抗体。DEV_K57在体外对多种变异株表现出中和广度，半数抑制浓度（IC₅₀）值达亚纳摩尔级。该体外效力在体内得到转化。在SARS-CoV-2 Delta感染的叙利亚金黄地鼠模型中，DEV_K57显著降低上、下呼吸道中的病毒RNA和感染性滴度，并表现出良好的安全性特征，组织病理学损伤轻微。为阐明其机制，研究人员进行了全面的生物物理和结构分析。生物层干涉术（BLI）显示其对RBD Delta具有高皮摩尔级结合亲和力。此外，尺寸排阻色谱联合小角X射线散射（SEC-SAXS）及计算建模揭示了DEV_K57 Fab-RBD复合物在溶液中独特且稳定的二聚体架构，其结合界面与既往已表征结构不同。这些发现凸显了快速分离抗体对未来新发生物威胁大流行防范的价值。

研究背景方面，SARS-CoV-2持续循环和进化，疫苗虽能降低重症风险，但特异性抗病毒治疗仍是重要方向；其中病毒中和单克隆抗体（mAbs）是治疗和预防COVID-19的重要生物制品。早期mAbs及其组合曾获紧急使用授权并显示临床获益，但RBD突变积累导致显著抗原漂移，多数早期抗体对流行变异株失去中和能力并退出临床使用；例如含P2C5的GamCoviMab在Delta的L452R和Omicron XBB.1的F490S出现后中和活性明显下降。即便后续报道的1p1B10等广谱抗体显示较好前景，仍需发现新的广谱中和抗体并阐明其广谱反应的结构基础，以支持针对高度突变病毒的治疗设计。基于此，研究人员从2023年感染SARS-CoV-2 Delta变异株的单一COVID-19康复供者外周血中分离B细胞，开展抗体发现、体内外功能评价、结合动力学和溶液结构研究，鉴定DEV_K57为靶向RBD的广谱中和人IgG1抗体，并在金黄地鼠模型中验证其体内效力；通过SEC-SAXS和计算建模揭示DEV_K57 Fab-RBD复合物的溶液态二聚体架构及不同于既往结构的结合界面，强调快速分离和表征康复者抗体对大流行防范的意义。

关键技术方法方面，样本来源为2023年SARS-CoV-2 Delta变异株感染的单一COVID-19康复供者45 mL外周血。主要技术包括：CD19⁺RBD⁺单B细胞分选；V_H/V_L特异性PCR及半巢式PCR获取抗体可变域序列；CHO-S细胞表达重组mAbs并纯化；ELISA筛选RBD结合；Vero E6细胞活病毒中和试验测定IC₅₀；金黄地鼠Delta感染模型评价病毒RNA、感染性滴度和组织病理；生物层干涉术（BLI）测定结合动力学；SEC-SAXS结合DAMMIF、GNOM、CRYSOL、AlphaFold3和FoldSeek进行溶液结构建模与比较。

研究结果如下。2.1 康复者B细胞来源重组单克隆抗体的制备：研究人员从1824个单B细胞获得91对V_H/V_L序列，选取40对，获得38个重组质粒及CHO-S稳定表达细胞系；ELISA显示18株对Delta反应、28株对Omicron BA.5.1反应、14株交叉反应、5株无特异反应；活病毒中和显示6株同时对Delta和Omicron BA.5.1有中和活性，12株仅对一株有活性（8株对Delta、4株对Omicron），20株在测试浓度下无中和活性；4株（DEV_K57、DEV_K51、DEV_K61、DEV_K55）同时具备双变异株ELISA结合和中和活性。2.2 DEV_K57对SARS-CoV-2变异株的中和活性：对2023年底可及的变异株 panel，DEV_K57高效中和Wuhan、Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron BA.1、BA.2和BN.1.3；对BA.5.2、BQ.1.1、BA.5.1、CL.1.2、CH.1.1、XBB.1.16、XBB.1.5和XBB.3保留中和活性；但对EG.5.1和JN.1中和活性显著降低（>500 IC₅₀），提示该高度突变变异株发生部分免疫逃逸。2.3 DEV_K57在SARS-CoV-2 Delta感染金黄地鼠模型中的体内效力：单次和三剂量腹腔注射均降低鼻甲和肺组织中的感染性病毒滴度及病毒RNA；Kruskal-Wallis检验显示组间显著异质性，Dunn检验显示单剂量组和三剂量组与对照组相比在鼻、肺组织感染性滴度上差异显著；组织病理学未见严重改变，单剂量组呈轻度局灶出血和轻度肺不张，三剂量组2只动物出现较大范围肺不张和较明显出血、其余6只肺组织学正常，实验组未见炎症细胞浸润。2.4 DEV_K57与SARS-CoV-2 RBD Delta的结合动力学：BLI显示DEV_K57与商业RBD Delta的K_D=1.08±0.1 pM，与自制RBD Delta的K_D=13.2±0.216 nM；商业IgG1相应K_D=19.2±0.1 pM和133±1.69 nM，DEV_K57亲和力更高，皮摩尔级亲和力为其竞争ACE2受体提供热力学基础。2.5 DEV_K57 Fab与SARS-CoV-2 RBD Delta的SEC-SAXS研究：连续收集2700帧SAXS数据，选取1119–1209帧分析；Guinier分析得R_g=59.4 ?、I(0)=0.061 a.u.、χ²=0.99，GNOM得R_g=62.4 ?、D_max=205 ?；多方法估计分子量约155–184 kDa，Bayesian估计为169.6 [151.4–176.6] kDa，约为单体Fab-RBD复合物（~80 kDa）的2倍，提示RBD在溶液中形成二聚体；DAMMIF重建显示2个RBD分子由2个DEV_K57 Fab桥接的二聚体组装，实验曲线与AlphaFold模型的χ²=1.9；FoldSeek筛选出5个同源RBD-mAb复合物，DEV_K57与pT1511（PDB ID: 8BG1）结合界面最相似，二者共享7个RBD氨基酸残基。

讨论部分总结：DEV_K57为靶向SARS-CoV-2刺突蛋白RBD的人IgG1单克隆抗体，对包括Omicron晚期谱系在内的多种变异株具有广谱中和活性；其体外可高效中和Wuhan、Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron BA.1、BA.2、BN.1.3，并对BA.5.2、BQ.1.1、BA.5.1、CL.1.2、CH.1.1、XBB.1.16、XBB.1.5和XBB.3保留可测中和活性，但对EG.5.1和JN.1活性显著下降。与S2E12、ZCB11、OMI-42、LY-CoV1404、COV2-2130、VIR-7831、BRII-196等既往RBD靶向抗体对XBB.1.5及后续变异株活性明显降低或丧失相比，DEV_K57显示突出中和广度；也优于仅Omicron感染后分离的1332E5和1332D4等抗体。研究人员选择Delta作为体内效力和详细生物物理表征的主要模型；金黄地鼠模型中单次和三剂量DEV_K57均显著降低鼻甲和肺组织感染性滴度和病毒RNA，组织病理损伤轻微，支持其转化潜力。BLI显示皮摩尔级K_D，高于商业参考IgG1约一个数量级，为应对高度进化变异株中的轻微结构波动或点突变提供强结合基础。SEC-SAXS显示DEV_K57 Fab-RBD复合物在溶液中形成稳定二聚体，实验分子量约为单体复合物2倍，提示DEV_K57结合可能保留或显著稳定RBD-RBD二聚界面。计算建模和比较结构分析发现与pT1511结构最相似并共享7个RBD接触残基，但pT1511功能表征尚未发表，不能将结构相似性直接外推为功能等效；同源抗体表位存在差异，而表位差异是中和谱和逃逸易感性不同的主要决定因素，靶向高度可变受体结合基序的抗体易被逃逸，靶向保守外周或隐蔽表位的mAbs可保持更广中和。局限性包括：DEV_K57分离和初步表征基于截至2023年底流行变异株，需持续监测和验证新变异株；SEC-SAXS和计算建模提供低分辨率信息，不能解析原子级细节，未来需X射线晶体学或冷冻电镜精确绘制互补位-表位界面，并进行结构优化以拓宽中和活性，在2024–2026年谱系中测试。尽管如此，DEV_K57为自然产生的人抗体，无需人工实验室改造即具广谱中和和皮摩尔级亲和力，对未来变异株治疗开发具有价值。

研究结论部分翻译：研究人员鉴定出DEV_K57，一种广谱中和人单克隆抗体，对SARS-CoV-2表现出交叉反应性、皮摩尔级亲和力和稳健的体内效力。通过将计算建模与SEC-SAXS数据整合，研究人员证明DEV_K57-RBD Delta结合界面可能不同于PDB中既往已表征的复合物结构。这些发现凸显了从康复者中快速分离和表征抗体的价值。