薄荷与罗勒提取物的植物化学特征及其与废水生物膜关联结构的相互作用研究

《Molecules》：Phytochemical Profiling of Mint and Basil Extracts and Their Association with Wastewater Biofilm-Associated Structures

　　

经处理的废水中微生物生物膜对水回用构成关注，因为微生物在处理后仍可附着于表面。本研究检测了胡椒薄荷（Mentha × piperita）、留兰香（Mentha spicata）、巧克力薄荷（Mentha × piperita f. citrata ‘Chocolate’）和罗勒（Ocimum basilicum）甲醇提取物的黄酮类化合物组成，并探究其与在补充了Luria–Bertani（LB）肉汤的经处理废水中于硅片上形成的苏云金芽孢杆菌生物膜的关联。每种植物提取物的终浓度为0.3%（v/v）。采用超高效液相色谱-高分辨串联质谱法（UPLC–HRMS/MS）鉴定并定量选定黄酮类化合物。利用扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱法（EDX）检测表面形态、细菌细胞尺寸及元素组成。提取物呈现独特的植物化学图谱。木犀草素-7-O-芸香糖苷是三种薄荷提取物中主要的定量黄酮类化合物，而罗勒主要含有山奈酚-3-O-芸香糖苷和山奈酚-3-O-葡萄糖苷。SEM图像显示，未处理、甲醇对照和植物提取物处理样品之间的表面关联结构存在差异。所选分散细菌细胞的纵向尺寸在不同处理间也存在变化。未处理和甲醇对照样品获得了厚度测量值，而代表性植物提取物处理样品中分散且轮廓不清的结构无法进行可靠的厚度测量。EDX分析显示所选表面区域的相对元素组成存在变异，不同处理间以及两种废水条件间均观察到差异。这些发现提供了所测植物提取物的化学和表面表征图谱，及其与苏云金芽孢杆菌生物膜关联结构的相互作用信息。

研究背景与科学问题

随着人口增长、工业化和农业发展，淡水资源日益紧缺，气候变化进一步加剧了这一挑战，促使人们寻求替代水源。经处理的城市废水因其在农业灌溉、景观用水、工业用途和地下水补给方面的潜力，成为可持续水资源管理的关键组成部分。然而，尽管废水处理工艺能有效降低悬浮固体、有机物、营养物和微生物的浓度，但处理后的废水中仍残留微生物，它们能够附着于水下表面并形成生物膜。生物膜是由被胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）基质包裹的有组织微生物群落组成，其主要成分包括多糖、蛋白质、脂质和胞外DNA。EPS基质有助于微生物附着于表面、截留营养物质，并保护内部微生物免受环境胁迫和化学处理的影响，从而使生物膜中的微生物相比浮游状态具有显著增强的抗性，难以清除。生物膜的形成会导致废水处理厂和输配系统中膜污染、管道堵塞、水质下降及运营成本增加等问题。因此，开发抑制微生物附着和生物膜形成的环境友好型技术具有重要意义。

此前的研究人员已在实验室中利用光谱学、显微学和生物化学方法对环境和生物系统中的微生物生物膜进行了长期探索，并以苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）为模式生物，研究了其在氯气和二氧化硫消毒的城市废水中的生物膜形成。植物源植物化学物质能够影响细菌附着、EPS产生、群体感应和生物膜成熟。已有研究表明，黄酮类及其他多酚类化合物可通过多种非单一抗菌功能影响细菌粘附、细胞间通讯、EPS合成、氧化应激反应和生物膜成熟。薄荷、留兰香、巧克力薄荷和罗勒均属于唇形科（Lamiaceae），富含酚类和黄酮类化合物，具备抑制细菌生长和生物膜发育的潜力。然而，植物的化学成分受物种、品种、生长条件和提取方法等多种因素影响，因此在建立化学性质与生物学效应之间的关系前，需首先对其化学图谱进行表征。

基于上述背景，本研究旨在探究胡椒薄荷、留兰香、巧克力薄荷和罗勒的甲醇提取物对在氯气和二氧化硫消毒的城市废水中生长的苏云金芽孢杆菌生物膜的影响，利用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术（UPLC–HRMS/MS）鉴定各提取物中的主要植物化学成分，并通过扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱法（EDX）分析不同处理下硅基底上生物膜形态和化学组成的变化。

主要关键技术方法

研究人员采用了以下几项关键技术方法开展研究：

1. 1.
   超高效液相色谱-高分辨串联质谱法（UPLC–HRMS/MS）：用于鉴定和定量四种植物甲醇提取物中的黄酮类化合物。该方法结合了色谱分离和高分辨质谱检测，并通过数据依赖性二级质谱（ddMS²）获取碎片信息，与标准品比对实现化合物确认。
2. 2.
   扫描电子显微镜（SEM）：用于观察硅片上生物膜的表面形态、细菌细胞尺寸及垂直结构厚度。
3. 3.
   能量色散X射线光谱法（EDX）：用于分析选定表面区域的元素组成，计算碳（C）、氮（N）、氧（O）、钠（Na）、氯（Cl）相对于硅（Si）的复合元素比。

研究中使用的废水样本来自德克萨斯州纳科多奇斯废水处理厂（NWWTP）的两个采样点：氯接触室（NC）和二氧化硫接触室（NS）。

研究结果

3.1 薄荷和罗勒提取物的植物化学表征

通过UPLC–HRMS/MS分析，研究人员成功区分了具有相同母离子质量的同分异构体，如漆黄素、木犀草素和山奈酚（m/z 285.040），以及桑色素和槲皮素（m/z 301.035），并建立了各自的保留时间和二级质谱特征。定量分析显示，四种提取物的黄酮类化合物分布存在显著差异。木犀草素-7-O-芸香糖苷（Lut7R）是留兰香（19.0 mg/mL）、胡椒薄荷（21.0 mg/mL）和巧克力薄荷（21.0 mg/mL）中的主要定量黄酮，而木犀草苷和木犀草素的含量则低得多。圣草酚仅在留兰香和巧克力薄荷中检出，胡椒薄荷中未检出。罗勒的图谱则完全不同，其主要定量黄酮为山奈酚-3-O-芸香糖苷和山奈酚-3-O-葡萄糖苷，木犀草素仅为痕量水平。这种薄荷中以木犀草素衍生物为主、罗勒中以山奈酚糖苷为主的分布模式与先前报道一致。

3.2 扫描电子显微镜和EDX分析

3.2.1 非生物对照

为建立基线，研究人员检测了未经暴露的硅片以及在无细菌条件下暴露于含0.3%（v/v）巧克力薄荷提取物的NC和NS基质中的硅片。SEM显示处理后的硅片表面出现不同于裸片的特征。EDX分析表明，裸片硅含量约99.0 wt%，而非生物NC和NS样品的硅含量分别降至76.5%和79.9%，同时检测到碳（NC: 16.3 wt%; NS: 14.0 wt%）和氮（NC: 2.2 wt%; NS: 1.9 wt%），证明碳和氮信号不能完全归因于细菌或EPS，还需考虑培养基和植物提取物的贡献。

3.2.2 SEM形态、分散细菌细胞尺寸及四区域EDX分析

SEM图像显示，不同处理条件下硅片表面的关联结构存在差异。在NC系列中，未处理对照的分散细胞平均纵向尺寸为1.85 ± 0.17 μm，罗勒（NC-BA）、巧克力薄荷（NC-CHM）和胡椒薄荷（NC-PPM）处理组的尺寸略低于对照，而留兰香（NC-SPM）处理组尺寸相近但变异更大。在NS系列中，未处理对照的细胞尺寸为1.80 ± 0.37 μm，巧克力薄荷（NS-CHM）处理组尺寸最大（2.05 ± 0.13 μm），留兰香（NS-SPM）处理组最小（1.50 ± 0.12 μm），胡椒薄荷（NS-PPM）和留兰香（NS-SPM）处理组均低于对照。这些结果表明细胞尺寸随植物提取物和废水条件而变化，但未呈现一致规律。

四区域EDX分析结果显示，NC系列中，未处理对照的(C+N+O+Na+Cl)/Si复合比为0.255，留兰香（NC-SPM）处理组最高（0.455），胡椒薄荷（NC-PPM）处理组最低（0.230），甲醇对照也低于未处理对照。NS系列中，未处理对照的复合比为0.104，巧克力薄荷（NS-CHM）和留兰香（NS-SPM）处理组较高（分别为0.432和0.412），罗勒（NS-BA）处理组接近对照，胡椒薄荷（NS-PPM）居中。多个条件的标准偏差较大，表明所选区域间元素组成存在空间异质性。

3.2.3 生物膜厚度及选定致密区域EDX分析

通过倾斜角度SEM成像测量生物膜厚度，NC样品平均厚度为2.44 ± 0.42 μm，NS样品为1.08 ± 0.10 μm，NC-Met样品为2.46 ± 0.44 μm。NS样品的生物膜层高度单独测量为0.78 ± 0.12 μm。代表性植物提取物处理样品（NC-BA、NS-PPM、NC-CHM、NS-CHM）表面呈现分散且轮廓不清的结构，无法获得可靠的厚度测量值。对另一批次样品中选定的致密区域进行EDX分析，NC、NS和NC-Met的复合比分别为3.08、1.46和3.58，而NC-BA（0.52）、NC-CHM（0.34）、NS-CHM（0.76）和NS-PPM（0.76）的比值较低。

总结与结论

本研究结合UPLC–HRMS/MS、SEM和EDX技术，表征了四种甲醇植物提取物，并探究了它们与在补充LB肉汤的处理废水中形成的苏云金芽孢杆菌生物膜的关联。质谱分析显示提取物的黄酮类化合物组成存在明显差异：木犀草素-7-O-芸香糖苷是三种薄荷提取物中的主要定量黄酮，而罗勒主要含有山奈酚糖苷。色谱分离和MS/MS分析还提供了一种区分具有相同母离子质量的选定黄酮类化合物的手段。

SEM结果显示，未处理、甲醇对照和植物提取物处理样品之间的表面关联结构存在差异。分散细菌细胞的纵向尺寸在不同实验条件下有所变化，但未呈现所有提取物的一致模式。在用于垂直结构检测的代表性植物提取物处理样品中，表面关联材料分散且轮廓不清，无法获得可靠的厚度测量值。这些观察描述了硅片上存在的结构差异，但不能确定细菌活力或总生物膜生物量的变化。

EDX分析为选定表面区域的元素组成提供了额外信息。四区域分析显示了样品内的空间变异，而对选定致密区域的单独分析则显示了该样品集中不同条件间的差异。这两种分析提供了互补信息，应分开解读。复合元素比是受硅片表面材料和下层硅衬底影响的描述性指标，不能独立确定生物膜生物量或EPS含量的变化。

总体而言，结果表明所测试的植物提取物处理与苏云金芽孢杆菌生物膜关联结构的形态和局部元素组成的差异相关联。独特的植物化学图谱为未来这些植物提取物的研究提供了有用信息。需要进一步开展关于生物膜生物量和细菌活力的直接测定研究，以确定这些提取物对生物膜形成的影响程度。