外源碳形态与剂量调控黑麦草辅助修复石油污染土壤的微生物机制研究

《Molecules》：Effects of Ryegrass and Exogenous Carbon Addition on Petroleum Hydrocarbon Removal and Soil Microbial Communities

　　

摘要 海湾战争遗留的大规模石油污染，加之干旱与贫瘠的养分条件，对科威特石油污染土壤的生物修复构成持续挑战。本研究考察了黑麦草（ryegrass）及不同形态的外源碳对石油烃去除和土壤微生物群落的影响。研究采用12个盆栽处理，将黑麦草种植与不同剂量的β-羟基丁酸（β-hydroxybutyric acid，HB）或聚羟基丁酸（polyhydroxybutyrate，PHB）相结合，应用于人工发动机油污染土壤。研究人员分析了总石油烃（total petroleum hydrocarbons，TPH）、有机酸、微生物群落及预测的烃降解功能。在第150天，黑麦草与500 mg/盆PHB联合处理产生了数值上最高的平均TPH去除率（39.09%），较未种植且未添加外源碳的对照组高出18.91个百分点。然而，最终TPH浓度与单独黑麦草处理或相同剂量（500 mg/盆）的单独PHB处理相比，差异不显著。增加PHB剂量反而降低了修复性能。HB与PHB产生了不同的有机酸变化模式，并显著影响细菌群落组成。在第60天，Massilia和Dyadobacter在黑麦草+PHB 500 mg/盆处理中相对丰度较高。基于16S rRNA基因序列的PICRUSt2分析将芳香族中间产物转化的预测基因家族归因于这些属。在第150天，Gordonia在黑麦草+HB 550 mg/盆处理中相对丰度较高。这些发现突出了可能与烃降解相关的类群，但其实际贡献仍需直接的功能验证。结果表明，外源碳的形态和剂量在测试条件下影响植物辅助修复及细菌群落响应。该研究对科威特田间污染土壤的适用性仍需进一步验证。

论文解读

一、研究背景与科学问题

1990至1991年海湾战争期间的大规模原油泄漏在科威特形成了大量油湖和污染土壤堆，覆盖油田土地面积约114 km2。经过数十年的风化，部分石油组分仍残留在污染土壤中。受污染面积广阔，使得土壤转运及能源和物质需求成为修复策略选择的主要制约因素，这凸显了原位微生物修复的实用价值。科威特气候炎热干燥，土壤养分贫瘠，有限的水分和养分供应可能制约微生物的烃降解活动。已有局部试验表明，灌溉结合翻混可改善石油去除效果，堆肥可通过生物刺激作用促进Burgan油田污染土壤中石油烃的降解。因此，改善土壤微生物环境是提高修复效率的重要手段。

植物通过根系活动改变局部土壤条件，并影响参与石油烃转化的微生物。科威特污染场地调查已鉴定出能够在石油污染生境中生长的本土植物。在黑麦草土柱试验中，种植土壤中脂肪烃消失更快，伴随微生物丰度和呼吸作用的增加。黑麦草与微生物菌株组合的烃降解效果存在差异，养分供应也影响黑麦草根际烃降解基因的丰度和表达。柴油胁迫还能改变黑麦草根系代谢物组成，其中部分代谢物可吸引特定细菌。

除根系输入外，可生物降解聚合物也能为部分土壤微生物提供碳源。微生物胞外酶可解聚聚(3-羟基丁酸)（PHB），释放包括β-羟基丁酸（HB）在内的低分子量产物。PHB相关共聚物颗粒可形成微生物快速生长和胞外酶活性升高的局部区域。PHB添加还会改变土壤呼吸、细菌和真菌群落以及养分转化。然而，部分PHB试验也报告了植物生物量降低的现象，响应取决于土壤砂含量、共施改良剂和接种条件。在未种植的农业土壤培养试验中，包括PHB在内的可生物降解微塑料减慢了多环芳烃的自然衰减。因此，微生物对改良剂的利用并不必然改善石油烃的去除。

根系输入也会在植物辅助修复过程中改变微生物可利用的碳环境。根系分泌物组成和培养阶段可影响烃降解基因的表达。稳定同位素示踪已直接将黑麦草根际特定微生物与苯并[a]芘的利用联系起来。根系输入可能改变微生物对HB或PHB添加的响应，未种植土壤中观察到的改良剂效应未必能直接转化到种植土壤中。

基于上述背景，研究人员提出两个假设：其一，黑麦草种植将改变土壤微生物群落对HB和PHB添加的响应；其二，在测试剂量范围内，增加任一改良剂的剂量不会持续改善TPH去除效果。经初步筛选候选植物后，研究选用黑麦草进行人工发动机油污染土壤的盆栽试验，采用完全交叉设计，将种植与否与六种改良剂条件（无改良剂、三种HB剂量、两种PHB剂量）相结合，在60天和150天评估修复性能，并考察土壤性质、细菌和真菌群落及预测的细菌烃降解功能，旨在识别具有良好TPH去除效果的处理及与较低残余TPH相关的候选类群，为后续基于培养的烃降解试验提供依据。

二、研究设计与关键技术方法

本研究采用盆栽试验，土壤采集自中国广州，风干过2.0 mm筛后，以每千克土壤50 mL的剂量添加SJ10W40矿物发动机油并充分混匀，目标TPH含量约为3.8%，该污染水平参考了科威特Burgan油田干油湖土壤的平均TPH浓度（35,740.6 mg/kg，约3.574%）。试验从2025年12月13日进行至2026年5月18日，共150天。两个种植水平（种植与不种植黑麦草）与六种改良剂条件完全交叉，形成12个处理，每处理3个独立盆栽，共36盆。HB剂量为150、350和550 mg/盆，对应碳输入量分别为55.4、129.2和203.1 mg C/盆；PHB剂量为500和1500 mg/盆，对应碳输入量分别为273.5和820.4 mg C/盆。试验在四面开放的遮雨棚下进行，定期浇水并补充养分。

关键技术方法主要包括：采用USEPA Method 9071B的索氏提取-重量法测定TPH；依据HJ 1021-2019标准，由外部检测实验室采用气相色谱-火焰离子化检测（GC-FID）分析C10-C40烃类；采用超高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱（UPLC-ESI-MS/MS）对65种有机酸进行靶向分析；使用DNeasy PowerSoil试剂盒提取DNA，对16S rRNA基因V4区和真菌ITS2区进行Illumina NovaSeq双端250 bp测序，经fastp质控和DADA2生成扩增子序列变异体（ASV），分别以SILVA v138和UNITE v8.0数据库进行分类学注释；采用PICRUSt2预测细菌KEGG同源（KO）功能并标准化为每百万计数（CPM）；使用主坐标分析（PCoA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）评估群落差异，ANCOM-BC2用于属水平差异丰度分析，limma用于预测功能的差异比较。

三、研究结果

3.1 不同处理下TPH和C10-C40的变化

人工污染后第0天TPH含量为3.757 ± 0.018%。在60至150天的后期修复阶段，各处理的TPH进一步下降，降幅为0.770至1.486个百分点。黑麦草+HB 150、350和550 mg/盆处理在此期间的降幅相对较大，分别为1.486、1.393和1.370个百分点。然而，在整个修复期（0-150天），黑麦草+PHB 500 mg/盆处理产生了最大的TPH降幅。第150天该处理TPH为2.289 ± 0.103%，较初始值降低39.09%。相比之下，未种植且未改良处理的TPH为2.999 ± 0.134%，降幅为20.18%，两者相差18.91个百分点。

单独黑麦草和未种植条件下PHB 500 mg/盆的TPH降幅分别为38.18%和38.80%，仅比黑麦草+PHB 500 mg/盆组合处理低0.91和0.29个百分点。这两个处理的最终TPH含量与组合处理无显著差异（p = 0.6631和p = 0.8774）。将PHB剂量提高至1500 mg/盆后，种植土壤的最终TPH为2.544 ± 0.053%，降幅为32.29%，比500 mg/盆低6.80个百分点，且较大剂量的最终TPH显著更高（p = 0.0037）。黑麦草+HB 150、350和550 mg/盆处理的最终TPH在2.314%至2.330%之间，未随HB剂量增加而持续下降。

在第60天，种植和改良剂条件对残余TPH有显著主效应，而交互作用不显著。平均而言，种植盆的残余TPH比未种植盆高0.156个百分点。在第150天，两个主效应及其交互作用均显著。C10-C40含量在第60天各处理间无显著差异（p = 0.2852），但第150天处理差异显著（p < 0.0001）。未种植+HB 550 mg/盆处理具有最低的最终C10-C40含量（0.928 ± 0.034%），但并非TPH最低的处理，表明基于C10-C40的处理排序与基于残余TPH的排序不完全对应。

3.2 HB和PHB添加下不同的有机酸动态

65种有机酸测定条目被归入六个化学结构类别，其中脂肪族和脂环族羧酸占27条，苯系羧酸及其衍生物占19条，合计占全部条目的70.8%。在60至150天期间，12种有机酸在所有六个种植处理中下降，9种在所有处理中上升，26种的变化方向因处理而异。(R)-3-羟基丁酸、L-苹果酸和乙酰丙酸在所有处理中均下降，而α-酮戊二酸和癸二酸均上升。辛二酸和壬二酸表现出显著的处理差异：两者仅在黑麦草+PHB 1500 mg/盆处理中上升，在其他五个处理中下降。

辛二酸和壬二酸在各处理间的变化方向尤为不同。从60到150天，其浓度在黑麦草+HB 550 mg/盆处理中分别下降97.5%和84.8%，但在黑麦草+PHB 1500 mg/盆处理中分别上升108.6%和176.1%。第150天，黑麦草+PHB 500 mg/盆处理中辛二酸、壬二酸和癸二酸浓度分别是黑麦草+HB 550 mg/盆处理的10.6、3.7和2.1倍，三者处理间差异均显著（Games-Howell，p < 0.05）。第150天，黑麦草+PHB 1500 mg/盆处理中(R)-3-羟基丁酸和L-苹果酸浓度分别为114.08 ± 26.17和33.53 ± 10.56 mg/kg，显著高于其他五个处理，但较同处理60天时分别低45.0%和87.9%。乙酰丙酸在所有六个处理中均大幅下降95.7-98.5%。第150天，乙酰丙酸和α-酮戊二酸在各处理间均无显著差异。

3.3 细菌和真菌群落对种植和外源碳添加的差异响应

优势细菌属在60天和150天间存在差异。第60天，全部36盆中平均相对丰度最高的三个已分类属为Massilia（14.03%）、Dyadobacter（7.55%）和Pseudomonas（4.35%）。在黑麦草+PHB 500 mg/盆处理中，Massilia和Dyadobacter的平均相对丰度分别为19.61%和11.77%，比单独黑麦草处理高出5.69和4.44个百分点。Massilia在未种植+PHB 500 mg/盆处理中占9.14%，比未种植且未改良处理低6.04个百分点。第150天，平均相对丰度最高的三个属为Phenylobacterium（5.58%）、Gordonia（5.40%）和Mycobacterium（4.97%）。Gordonia在黑麦草+HB 550 mg/盆处理中占8.27%，比单独黑麦草高2.44个百分点。Mycobacterium在黑麦草+PHB 500 mg/盆处理中占10.01%，比单独黑麦草高4.25个百分点。Cavicella在未种植+PHB 1500 mg/盆处理中占8.92%，比未种植且未改良处理高4.23个百分点。

在探索性属水平分析中，经BH校正后仅三个已分类细菌属在所有可估计的处理比较中保持显著并通过伪计数敏感性检验，且均出现在未种植土壤中。第60天，未种植+HB 350 mg/盆和未种植+PHB 500 mg/盆处理中Cnuella的偏差校正丰度低于未种植且未改良处理（均q = 0.020）。第150天，未种植+HB 350 mg/盆、HB 550 mg/盆和PHB 500 mg/盆处理中Citrifermentans的校正丰度低于未种植且未改良处理（q = 0.0011-0.020）。未种植+HB 550 mg/盆处理中Rhodopseudomonas的校正丰度高于未种植且未改良处理（q = 0.020）。种植土壤中无细菌属同时满足显著性和敏感性检验标准。

PCoA显示60天和150天时种植与未种植样品均存在分离。改良剂处理在细菌群落中分化更明显，而真菌样品重叠更多。PERMANOVA显示细菌群落在两个采样时间均存在显著种植效应，Hellinger转换后的欧氏距离和Bray-Curtis距离结果一致（均q = 0.0006）。真菌群落在60天也存在种植效应，但第150天仅在Hellinger分析中显著（q = 0.0127），Bray-Curtis分析中不显著（q = 0.1214）。种植对细菌群落的影响在两个采样时间均一致，而第150天真菌结果取决于距离度量。

当以六个独立水平分析各改良剂剂量时，细菌群落的显著效应主要出现在第150天。在Hellinger分析中，改良剂和改良剂×种植交互作用分别解释21.1%和19.8%的群落变异（q = 0.0024和0.0174）。将三个HB剂量合并为HB类别、两个PHB剂量合并为PHB类别后，无改良剂、HB和PHB之间的总体差异在两种种植条件和两个采样时间下对细菌均显著（R2 = 0.124-0.133，q ≤ 0.0144）。在未种植土壤中，第60天三个类别间所有两两比较均显著；第150天HB和PHB均与无改良剂有差异。在种植土壤中，第60天无两两比较在校正后显著；第150天仅HB与PHB显著不同（q = 0.020）。真菌群落在两个采样时间均无显著的改良剂主效应或种植×改良剂交互作用（q ≥ 0.0566）。

3.4 预测烃降解功能的处理相关变异

PICRUSt2预测表在第60天包含7766个KO，第150天包含7788个KO。按采样时间和种植状态分别进行PCA，前两轴共同解释52.79-67.11%的预测功能组成变异。将剂量合并为无改良剂、HB和PHB类别后，在种植60天、未种植60天、种植150天和未种植150天四个子集中，改良剂类别分别解释10.41%、8.44%、14.52%和23.18%的功能变异，未校正p值分别为0.5982、0.7318、0.2372和0.0416。经联合BH校正后，对应q值分别为0.7318、0.7318、0.4744和0.1664，均不显著。尽管细菌群落组成的四个改良剂类别检验在校正后均显著，但预测功能的整体处理差异缺乏相应的校正后统计支持。

研究详细考察了与石油烃转化直接相关的七个KO，涵盖初始烷烃氧化（alkB/alkM）、苯甲酸活化（benA/xylX和benB/xylY）、邻苯二酚环裂解（dmpB/xylE和catE）以及原儿茶酸环裂解（pcaG和pcaH）。第150天六个种植处理中，黑麦草+PHB 500 mg/盆处理的alkB/alkM、pcaG和pcaH平均预测丰度最高，分别为224.09、240.91和271.75 CPM，而单独黑麦草对应值分别为165.02、209.80和240.73 CPM，三者差异经BH校正后均不显著（q = 0.555-0.678）。

在七个KO的140个预设比较中，仅未种植+PHB 1500 mg/盆处理第150天的pcaG在校正后保持显著，其预测丰度为184.93 ± 5.72 CPM，比未种植且未改良处理的125.63 ± 13.51 CPM高47.21%（q = 0.0287）。同一酶复合物的另一亚基pcaH校正后不显著（q = 0.1737），其他焦点KO均未检测到显著差异。这一显著结果出现在接受PHB 1500 mg/盆的未种植土壤中，而黑麦草+PHB 500 mg/盆产生了最大的TPH降幅，因此单一预测KO的增加并不对应更好的修复性能。

四、讨论与结论

在讨论部分，研究人员指出，当以TPH降幅作为修复性能的唯一标准时，黑麦草+PHB 500 mg/盆在第150天产生39.09%的平均降幅，为测试处理中的最高数值。未种植且未改良处理降幅仅20.18%，相差18.91个百分点。种植与未种植处理的匹配比较显示，黑麦草的效益在无外源碳添加时最为明显，使TPH降幅从20.18%提高至38.18%，增加18.00个百分点，这与根际刺激微生物烃降解一致。相比之下，接受相同HB或PHB剂量的种植与未种植处理间最终TPH无显著差异，表明碳改良条件下种植未带来额外的显著效益。

PHB作为聚合物需先经微生物解聚为低分子量产物，可能提供较缓慢而持续的碳输入。第60天，Massilia和Dyadobacter在黑麦草+PHB 500 mg/盆处理中的相对丰度较高，分类学归因显示Massilia占预测dmpB/xylE的41.23%，Dyadobacter占预测catE的46.99%，提示这些属可能参与芳香族石油烃中间产物的转化。然而，与单独黑麦草的差异在校正后不显著，单个类群对TPH去除的贡献仍需靶向功能研究评估。

PHB的效益不随剂量增加。黑麦草+PHB 1500 mg/盆的TPH降幅为32.29%，比500 mg/盆低6.80个百分点，最终TPH显著更高。较高添加量可能促使微生物更多利用聚合物来源碳或加剧氮和氧竞争，从而削弱石油烃利用。尽管未直接监测PHB降解、土壤氧可用性和氮动态，所提出的机制为观察到的剂量差异提供了合理解释。

在三种碳环境比较中，单独黑麦草和黑麦草+HB 550 mg/盆的群落组成相对相似，而黑麦草+PHB 1500 mg/盆中Paracoccus和Gordonia下降、Penicillium上升，且保留了相对较高的3-羟基丁酸、苹果酸及多种二羧酸浓度。HB作为小分子可较快进入微生物碳代谢，可能先刺激快速利用小分子碳的细菌，随后富集也能转化烃的类群。PHB则通过逐步解聚创造持续碳供给的生态位。这些解释涉及种植土壤中的改良剂响应，单个类群的代谢活动或底物利用仍需培养降解试验、功能基因表达测定或其他直接代谢证据验证。

HB和PHB改良剂在细菌群落中产生比真菌群落更一致的组成差异。细菌对碳添加的响应表现为群落组成改变，而真菌可能主要通过丰度增加来响应。植物存在改变了细菌对外源碳的响应。由于HB和PHB处理未进行碳匹配，碳源特性和碳输入量的效应无法完全分离。试验使用人工添加发动机油的广州土壤和矿物发动机油，而非长期田间污染的科威特土壤，相似的TPH浓度并不等同污染物组成、老化程度、生物可利用性、土壤理化性质或土著微生物群落的一致性。盆栽在遮雨棚下维持并定期灌溉施肥，未复现科威特田间环境条件。由于未控制盆中淋溶，观察到的TPH下降不应被解释为生物降解的直接度量。

研究结论为：在150天修复期内，黑麦草与PHB 500 mg/盆联合处理产生数值上最高的平均TPH降幅（39.09%），超过未种植且未改良对照18.91个百分点，但与单独黑麦草或相同剂量单独PHB的最终TPH无显著差异。将PHB剂量提高至1500 mg/盆显著增加了种植土壤的最终残余TPH，表明外源聚合物的更大碳输入并不必然改善石油烃去除。六个种植处理中，HB和PHB产生了不同的有机酸变化模式和微生物群落响应。HB 550 mg/盆处理中辛二酸和壬二酸在后期大幅下降，伴随较高的Gordonia和Paracoccus丰度；PHB 1500 mg/盆与部分有机酸的后期积累及较高Penicillium丰度相关。群落分析显示细菌比真菌对外源碳的组成差异响应更一致，植物存在改变了细菌对外源碳的响应。适度PHB添加可能是调控植物辅助修复石油污染土壤的候选策略，但更高聚合物剂量未提供额外修复效益。鉴于有限的生物学重复（每处理3个独立盆栽），微生物群落分析的生态学结论应谨慎解读。未来工作应结合使用科威特本地污染土壤的相关环境与管理条件试验，并测量聚合物降解动态和直接测定烃降解功能，以阐明外源碳利用与石油烃降解之间的关系，指导植物-微生物修复策略的优化。