肉桂与牛至精油联合环丙沙星对临床相关细菌的协同与相加抗菌作用研究

《Antibiotics》：Synergistic and Additive Effects of Binary Combinations of Ciprofloxacin with Origanum vulgare L. or Cinnamomum cassia (L.) J. Presl. Essential Oil Against Medically Relevant Bacteria

　　

摘要 背景/目的：细菌对抗菌药物的耐药性已成为全球性公共卫生问题，限制了常规治疗的有效性。因此，联合抗菌治疗已被提出作为对抗多重耐药细菌的策略。本研究旨在探讨环丙沙星（ciprofloxacin, CIP）与肉桂（Cinnamomum cassia (L.) J. Presl.）精油（CEO）及牛至（Origanum vulgare L.）精油（OEO）的二元组合对鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、准肺炎克雷伯菌（Klebsiella quasipneumoniae）、副铜绿假单胞菌（Pseudomonas paraeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抗菌效果。方法：研究人员对单一化合物及其组合进行了溶血活性评价。抗菌活性通过双抗菌梯度肉汤稀释法和时间-杀菌曲线法测定。结果：CEO–CIP与OEO–CIP组合在人红细胞中分别表现出4.04%至3.35%和3.39%至2.29%的溶血活性，并呈现协同、相加及无关抗菌效应。CEO–CIP组合使CIP对MRSA的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration, MIC）从256 μg/mL显著降低至0.125 μg/mL。OEO–CIP对副铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌具有杀菌作用；而CEO–CIP组合对副铜绿假单胞菌表现出杀菌活性，但在24 h后仅使金黄色葡萄球菌活力降低1.83 log。结论：研究结果表明，CEO–CIP组合对鲍曼不动杆菌、准肺炎克雷伯菌、副铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌及MRSA具有抗菌作用，且在测试浓度下溶血活性低于5%。尽管研究仅限于体外条件，但这些结果凸显了该组合的治疗潜力，并强调需进一步研究其作用机制及体内毒性。

论文解读：肉桂精油与环丙沙星联合抗多重耐药菌的研究进展

一、研究背景与意义

抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）已成为当前威胁人类健康的最严重问题之一。既往研究估计，若不采取有效控制措施并开发新型治疗替代方案，到2050年抗菌药物耐药性感染每年可能导致超过1000万人死亡。最近，Naghavi等人预测2025年至2050年间全球因AMR导致的累计死亡人数将超过3900万。这一形势对社会经济发展产生负面影响，加重卫生系统负担，增加包括住院和用药在内的治疗相关成本。此外，细菌耐药性还可影响国际贸易和畜牧业，可能造成比2008年金融危机更为严重的经济影响。

在与AMR相关的病原体中，鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌在2019年因多重耐药菌感染导致的495万死亡病例中约占72%。此外，属于肺炎克雷伯菌复合体的准肺炎克雷伯菌，以及在环境谱系上与铜绿假单胞菌相似且对最后一线抗生素显著耐药的新型物种副铜绿假单胞菌，也因其对抗生素的耐药性而引起关注。这些微生物对人类健康产生巨大负面影响，可引起皮肤、软组织、烧伤和伤口感染，以及肺炎、继发性脑膜炎、心内膜炎、慢性鼻窦炎、菌血症和脓毒症等疾病。这些感染的治疗管理因耐药表型（包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA）日益增多而更加复杂，MRSA与有限的治疗选择及显著的发病率和死亡率相关。因此，开发能够恢复或增强现有抗菌药物活性的替代策略仍是重要的研究优先事项。

精油作为天然、复杂、液态且易挥发的化合物，通常由芳香植物的次生代谢产生，其抗菌潜力备受关注。肉桂精油（CEO）和牛至精油（OEO）已被证明具有广谱抗菌活性，包括对多重耐药菌株的抑制作用。两种精油均已被香料和提取物制造商协会专家小组评估，并被列入公认安全的食品调味物质。然而，精油也存在一定局限性，包括在某些溶剂中溶解度差以及强烈的气味或风味。将精油与常规抗菌药物联合使用是克服这些局限性的策略，因为其不同的作用机制可能增强抗菌效力，加速抗菌效果，或允许使用更低浓度的药剂。

环丙沙星（CIP）作为第二代氟喹诺酮类药物，因其对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的作用而被用作医院和临床环境的一线治疗药物。尽管其使用广泛，但临床重要病原体对氟喹诺酮类的耐药性日益增加。因此，能够增强CIP活性或降低其抗菌所需浓度的策略尤为值得关注。

二、研究内容与主要技术方法

本研究旨在评价肉桂精油和牛至精油分别与环丙沙星二元组合的溶血活性及其对临床相关革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌（包括MRSA）的抗菌潜力。研究采用了以下关键技术方法：人红细胞溶血活性测定法，用于评价化合物单独及联合使用时对人红细胞的溶血百分比；肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC），评价各化合物单独抗菌活性；双抗菌梯度肉汤稀释法测定二元组合的抗菌相互作用，并通过计算分数抑菌浓度指数（FICI）判定协同（≤0.5）、相加（>0.5且≤1）、无关（>1且<4）或拮抗（≥4）效应；时间-杀菌曲线法评价抗菌作用的动力学特征。细菌菌株包括来自美国典型培养物保藏中心（ATCC）的标准菌株鲍曼不动杆菌ATCC 19606、准肺炎克雷伯菌ATCC 700603、副铜绿假单胞菌ATCC 9027和金黄色葡萄球菌ATCC 6538，以及由隆德里纳大学医院提供的三株MRSA临床分离株。

三、研究结果

3.1 化合物的溶血活性

单一化合物、标准菌株MIC浓度下的化合物以及OEO–CIP和CEO–CIP组合均未达到使细胞活力较未处理对照降低50%所需的浓度（CC₅₀）。CIP最高测试浓度（8 μg/mL）仅显示3.49%的溶血率，未发现其CC₅₀。OEO的CC₅₀范围为2.962至5.925 mg/mL（溶血率分别为15.78%和72.06%），接近其MIC范围0.740–2.962 mg/mL。相比之下，CEO的CC₅₀介于13.312至26.625 mg/mL之间（溶血率分别为8.67%和55.18%），是其MIC范围0.416–3.328 mg/mL的四倍以上。CEO–CIP和OEO–CIP组合在特定浓度下较各自单独化合物表现出略高的溶血百分比，但所有联合处理在测试浓度下（尤其在MIC时）均未在红细胞中观察到CC₅₀。基于这些结果，CEO在最高测试浓度下表现出显著低于OEO的红细胞溶血率，因此研究重点聚焦于CEO。

3.2 化合物单独的最低抑菌浓度

CIP、CEO和OEO均抑制了所有受试菌株的生长。MIC值范围为：CIP 0.125至256 μg/mL，CEO 0.416至3.328 mg/mL，OEO 0.740至2.962 mg/mL。

3.3 二元组合的最低抑菌浓度

CEO–CIP和OEO–CIP二元组合的MIC值显著低于各自单独处理，产生协同、相加或无关的抗菌相互作用。对于副铜绿假单胞菌ATCC 9027、金黄色葡萄球菌ATCC 6538及三株MRSA菌株，CIP与CEO联合时其MIC显著降低。同样，CIP与OEO联合时，对准肺炎克雷伯菌ATCC 700603、副铜绿假单胞菌ATCC 9027和金黄色葡萄球菌ATCC 6538的MIC也显著降低。特别值得注意的是，CEO与CIP联合时，CIP对MRSA的MIC从256 μg/mL降至0.125 μg/mL，降低了2048倍。

3.4 时间-杀菌曲线

对于革兰氏阴性菌副铜绿假单胞菌ATCC 9027和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌ATCC 6538，OEO在MIC值（2.962 mg/mL）下处理10秒后即未检测到活细胞。CEO在MIC值（3.328 mg/mL）下处理5分钟后使副铜绿假单胞菌减少2.41 log，15分钟后达到杀菌效果；对金黄色葡萄球菌处理15分钟减少1.52 log，30分钟减少2.78 log，1小时后未检测到活细胞。CIP单独在其MIC值下未能消除这两种菌株，且在10小时后细菌种群出现增长。CIP与OEO联合导致CFU/mL下降速度快于单独CIP处理：对副铜绿假单胞菌在相加MIC值（CIP 0.125 μg/mL和OEO 1.481 mg/mL）下处理5分钟后即表现出杀菌活性；对金黄色葡萄球菌在协同MIC值（CIP 0.016 μg/mL和OEO 0.740 mg/mL）下处理7小时后活细胞完全减少。CIP与CEO联合对副铜绿假单胞菌在相加MIC值（CIP 0.063 μg/mL和CEO 1.664 mg/mL）下处理2小时后完全消除可检测活细胞；但对金黄色葡萄球菌在协同MIC值（CIP 0.016 μg/mL和CEO 0.832 mg/mL）下24小时后仅使细胞群减少1.83 log。

四、讨论与结论

讨论部分总结：本研究表明肉桂精油和牛至精油具有强效抗菌活性，与既往文献一致。CEO对MRSA分离株的MIC为1.664 mg/mL，对其他细菌的MIC为0.416至3.328 mg/mL。OEO的MIC范围为0.740至2.962 mg/mL，与文献结果相符。时间-杀菌试验显示OEO在MIC值下可立即消除两种受试菌株的全部细胞群，CEO MIC值在15分钟（副铜绿假单胞菌）和1小时（金黄色葡萄球菌）内未检测到活细胞。CIP单独表现出抑菌活性，未达到3 log或以上的减少。CEO–CIP组合对MRSA使所需CIP浓度降低2048倍，这可能与精油和常规抗菌药物互补的作用机制有关——CEO和OEO的主要成分肉桂醛（80%）和香芹酚（72%）据报道可引起细菌细胞膜的结构和功能损伤，增加膜通透性，从而促进CIP在细胞内的积累，同时可能抑制外排泵。OEO–CIP组合在亚抑菌浓度下对副铜绿假单胞菌5分钟、金黄色葡萄球菌7小时内未检测到活细胞，而CEO–CIP组合对副铜绿假单胞菌2小时内未检测到活细胞，对金黄色葡萄球菌24小时减少1.83 log。两种组合在MIC值下均未显示高百分比的红细胞溶血（CEO–CIP为3.35%至4.04%，OEO–CIP为2.29%至3.39%），均低于5%。研究存在若干局限性，包括细菌面板相对较小、主要使用参考菌株、仅纳入三株MRSA临床分离株且未对其实验OEO–CIP组合、精油批次未通过独立分析方法表征、溶血试验仅使用单一健康供体血液，以及未进行直接机制实验和体内研究。

结论翻译：本研究证明了肉桂精油与CIP联合对鲍曼不动杆菌、准肺炎克雷伯菌、副铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的协同、相加和无关相互作用。值得注意的是，在测试浓度下，对MRSA菌株（迫切需要新型抗生素替代方案的病原体）的CIP所需抑菌浓度降低了2048倍。此外，CEO在MIC值下以及CEO–CIP和OEO–CIP组合的溶血活性表明红细胞溶血率低于5%。本文还展示了牛至精油与环丙沙星联合的抗菌组合及其作用动力学。研究人员强调肉桂精油与环丙沙星联合时具有强大的抗菌活性，显著降低了CIP对MRSA的MIC，表现出抗菌协同和相加相互作用，对副铜绿假单胞菌具有杀菌活性，且在标准菌株MIC值下的溶血活性低于CC₅₀。总之，这些发现表明将这种精油与环丙沙星联合可能是增强对多重耐药病原体抗菌效力的有前景的策略。然而，在考虑潜在的临床应用之前，需要进一步研究以阐明抗菌机制并评价其体内疗效和安全性。