生物源银纳米颗粒与Scaptotrigona bipunctata蜂蜜联用对参考及多重耐药细菌病原体的协同与相加抗菌活性

《Antibiotics》：Synergistic and Additive Antibacterial Activity of Biogenic Silver Nanoparticles Combined with Scaptotrigona bipunctata Honey Against Reference and Multidrug-Resistant Bacterial Pathogens

　　

背景/目的：耐药性和毒性限制了感染性烧伤的局部治疗药物。研究人员评价了生物源银纳米颗粒（biogenic silver nanoparticles，bio-AgNPs）与巴西无刺蜂Scaptotrigona bipunctata蜂蜜（SB蜂蜜）的联合应用。方法：以3种无刺蜂蜂蜜和意大利蜜蜂（Apis mellifera）蜂蜜及bio-AgNPs，对11株参考菌株和多重耐药（multidrug-resistant，MDR）菌株进行筛选，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）、MDR大肠埃希菌（Escherichia coli）和MDR铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。将活性最强的SB蜂蜜与bio-AgNPs联合，采用棋盘微量稀释法（部分抑菌浓度指数，FICI）、时间-杀菌曲线和扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）进行评价。在HaCaT角质形成细胞中测定各药物的细胞毒性。结果：该组合对3株革兰阴性菌呈协同作用（FICI 0.50），对3株革兰阳性菌呈相加作用（FICI 0.75），两种药物的抑制浓度均降低达4倍。与任一单药在其最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）下的效果相比，该组合使MDR铜绿假单胞菌（30 min对60 min）和金黄色葡萄球菌（7 h对10–24 h）的活菌数更快降至检测限以下，而对大肠埃希菌则在两种药物浓度均低2–4倍时达到与最快单药相同的效果。SEM显示细菌表面损伤和不完全分隔。这些降低后的浓度均低于各药物的半数细胞毒性浓度（50% cytotoxic concentration，CC₅₀），从而提高了计算选择性指数。结论：bio-AgNPs与SB蜂蜜在低于各药物细胞毒性阈值的浓度下，对受试的与烧伤感染相关的参考菌株和MDR菌株发挥联合抗菌作用，支持其进一步开发为局部抗菌药物。

论文解读：生物源银纳米颗粒与Scaptotrigona bipunctata蜂蜜联合抗多重耐药菌的研究

研究背景与目的

抗菌药物耐药性已成为全球公共卫生的重大威胁，预计到2050年耐药菌感染可能导致超过3900万人死亡。烧伤患者因皮肤屏障丧失和免疫功能受损，尤其易发生机会性感染；铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）及鲍曼不动杆菌等多重耐药（multidrug-resistant，MDR）病原体在烧伤创面感染中常见，并增加病死率。传统治疗对MDR感染常效果有限，因此迫切需要能规避耐药机制且安全有效的新策略。银纳米颗粒（silver nanoparticles，AgNPs）和蜂蜜具有广谱抗菌活性；蜂蜜在反复暴露下很少诱导稳定耐药，巴西无刺蜂蜂蜜可能具有独特的生物活性成分。AgNPs在高浓度下有毒性，但与其他药物联用可在较低剂量下发挥作用；蜂蜜对宿主组织耐受良好，二者联用有望降低各自有效浓度并减少毒性。本研究使用的生物源银纳米颗粒（biogenic silver nanoparticles，bio-AgNPs）由Trichilia catigua（catuaba）树皮提取物绿色合成，表面带有植物化学物封端层，与化学合成的纳米颗粒不同。既往蜂蜜-AgNPs联用研究均采用化学合成纳米颗粒和意大利蜜蜂蜂蜜或无明确来源蜂蜜，无刺蜂蜂蜜与生物源纳米颗粒的联用尚属空白。因此，研究人员系统评价了bio-AgNPs与Scaptotrigona bipunctata（SB）蜂蜜联合对烧伤创面相关参考菌株和MDR菌株的抗菌活性、杀菌动力学、形态学影响及细胞毒性。

研究内容与主要结论

研究人员首先测定4种蜂蜜（S. bipunctata、Tetragona clavipes、Tetragonisca angustula、Apis mellifera）和bio-AgNPs对11株参考及MDR菌株的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC），选出活性最强的SB蜂蜜进行棋盘联合试验、时间-杀菌曲线、扫描电镜和HaCaT细胞毒性试验。结果发现该组合对3株革兰阴性菌呈协同（FICI 0.50）、对3株革兰阳性菌呈相加（FICI 0.75），使两种药物抑制浓度降低2–4倍；对MDR铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的杀菌速度快于任一单药，对大肠埃希菌则在两种药物浓度均更低时达到与最快单药相同速度；电镜显示细菌表面损伤和不完全分隔；组合所需浓度低于各药物CC₅₀，选择性指数（selectivity index，SI）升高。这些结果支持该生物源组合作为烧伤创面局部抗微生物制剂的进一步开发。

关键技术方法

采用微量肉汤稀释法按CLSI指南测定MIC/MBC；棋盘微量稀释法计算部分抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index，FICI）判定协同/相加；时间-杀菌曲线通过菌落计数评价杀菌动力学；扫描电子显微镜观察形态；MTT法测定HaCaT细胞毒性并计算选择性指数。样本来源：参考菌株来自巴西隆德里纳州立大学（UEL）微生物学系基础与应用细菌学实验室；临床MDR分离株包括MRSA BMB9393（巴西流行克隆）、P. aeruginosa 2491（隆德里纳大学医院）和E. coli 5616（阿道夫·卢茨研究所）；蜂蜜采自巴西隆德里纳和Sertaneja的养蜂场；bio-AgNPs由GRAL Bioativos公司以Trichilia catigua树皮提取物按专利方法合成。

研究结果

2.1 蜂蜜pH与单剂基线抗菌筛选

4种蜂蜜pH均呈酸性：A. mellifera 3.50±0.10，SB蜂蜜3.45±0.09，T. angustula 3.88±0.12，T. clavipes 4.10±0.09。常规A. mellifera蜂蜜总体活性有限，多数参考菌株MIC为20%（v/v），且对MRSA BMB9393、MDR E. coli 5616和K. pneumoniae ATCC 10031在所测最高浓度下无抑制作用。无刺蜂蜂蜜中SB蜂蜜活性最强，尤其对革兰阳性菌MIC为1.25%–2.5%（v/v）；T. clavipes和T. angustula次之（5%–20%）。bio-AgNPs对革兰阴性菌MIC最低，P. aeruginosa ATCC 27853为15.62 μM，A. baumannii ATCC 19606和K. pneumoniae ATCC 10031均为31.25 μM；对革兰阳性菌为31.25–250 μM。SB蜂蜜因全谱MIC/MBC最低被选为联合对象。

2.2 协同与相加相互作用

棋盘试验显示，SB蜂蜜与bio-AgNPs联合对E. coli ATCC 25922、P. aeruginosa ATCC 27853和MDR P. aeruginosa 2491均呈协同作用（FICI≤0.50），无无关或拮抗作用；协同条件下SB蜂蜜MIC从5.00%降至1.25%（v/v），bio-AgNPs MIC也降低4倍。对S. aureus ATCC 25923、MRSA BMB9393和S. epidermidis ATCC 12228则呈相加作用（FICI=0.75），所需浓度降低2–4倍。

2.3 时间-杀菌动力学

24 h时间-杀菌曲线中，组合（31.25 μM bio-AgNP + 2.5% v/v SB蜂蜜）使E. coli ATCC 25922在4 h内降至检测限（limit of detection，LOD）以下，与单用125 μM bio-AgNP速度相同但所用浓度低4倍；单用10% SB蜂蜜需7 h。对S. aureus ATCC 25923，单药需10–24 h降至LOD以下，组合（31.25 μM bio-AgNP + 1.25% SB蜂蜜）7 h即达该终点，且蜂蜜浓度减半、纳米颗粒浓度降为1/4。对MDR P. aeruginosa 2491，24 h设计中所有处理在首个取样点（2 h）均已清除，因此进行短间隔试验；单药各需60 min降至LOD以下，组合30 min即达到，15 min时组合已使活菌数降低2.9 log₁₀，而单药仅降低0.13和0.34 log₁₀。

2.4 扫描电镜观察表面形态改变

以高于药敏试验的细胞密度、固定处理3 h观察S. aureus ATCC 25923。低倍镜下，未处理对照形成致密近融合层；SB蜂蜜或bio-AgNP单药处理细胞覆盖度仍较高但形成离散聚集体；组合是唯一显示覆盖度明显降低的条件，即使两种药物浓度均低于单药处理（蜂蜜减半、纳米颗粒1/4）。高倍镜下，单药处理细胞多保持球形但出现局部表面突起，偶见失去球形轮廓的无定形细胞；组合组中不完全分裂分隔的细胞频率更高。

2.5 体外细胞毒性与选择性指数

HaCaT细胞中，bio-AgNP的CC₅₀为64.00 μM（95%置信区间[confidence interval，CI] 61.38–66.61），SB蜂蜜为7.79% v/v（95%CI 6.94–8.63）。单独应用时，各药物对多数菌株的选择性指数（selectivity index，SI）处于1.02–1.56附近，表明抑菌浓度与细胞毒性浓度接近；组合将所需抑菌浓度降低最多4倍，使基于组合的SI在所有受试菌株中升高，bio-AgNP的SI对多数菌株达4.10，对P. aeruginosa ATCC 27853达16.41；SB蜂蜜对S. epidermidis ATCC 12228达24.92。组合所需浓度低于各单药的细胞毒性阈值。

讨论与结论

讨论

研究人员提出，SB蜂蜜的抗菌活性可能由过氧化氢（H₂O₂）依赖和非过氧化物成分共同介导；过氧化氢可诱导氧化应激和DNA损伤，酚酸和黄酮类化合物（如槲皮素、对香豆酸、阿魏酸、丁香酸）主要作用于细胞被膜和DNA旋转酶。革兰阴性菌因外膜屏障而对SB蜂蜜敏感性较低，但该屏障并非绝对。bio-AgNPs的活性主要来自氧化溶解持续释放Ag⁺，而非完整颗粒进入细胞；其表面Trichilia catigua封端层可能促进与膜脂的相互作用。两者联用时，蜂蜜中的过氧化氢可能与Ag⁺发生类Fenton反应产生羟自由基，同时酚酸介导的外膜通透化和纳米颗粒驱动的膜损伤可相互促进对方进入靶点，从而降低所需浓度。关于革兰阳性结果的解释，若采用Odds较保守标准，FICI 0.75可视为无相互作用，但革兰阴性菌的协同分类不受影响。既往化学合成AgNPs与蜜蜂蜂蜜联用结果不一致，提示相互作用依赖于封端层和蜂蜜成分。组合的快速杀菌作用对烧伤创面管理有意义，因为附着和胞外聚合物在数小时内开始。SEM中不完全分隔与蜂蜜干扰细胞分裂的报道一致。单独药物SI接近1，组合后SI显著增加；但细胞毒性仅为单药测定，组合的实际毒性需直接测量和体内验证。研究局限性包括机制未经直接验证、时间-杀菌试验未在组合浓度下测试各单药、全部为体外数据。

结论（翻译）

将生物源银纳米颗粒与Scaptotrigona bipunctata蜂蜜联用，在与测试的6株菌株中，该组合对3株革兰阴性菌产生协同抗菌作用，对3株革兰阳性菌产生相加作用，其中包括MDR分离株MRSA BMB9393和P. aeruginosa 2491。在所有情况下，该组合均降低两种药物达到抑制所需的浓度。在时间-杀菌试验中，组合以低于单药处理的浓度，对MDR P. aeruginosa 2491和金黄色葡萄球菌比任一单药更快地将活菌数降至检测限以下，对大肠埃希菌则与最快单药速度相当。扫描电镜显示金黄色葡萄球菌表面破坏和更多不完全分裂分隔。组合所需的降低浓度也低于各单药的细胞毒性阈值，提高了计算选择性指数。综上，这些结果在体外证明两种生物源药物可以联合使用，在显著降低各自剂量的情况下对与烧伤创面感染相关的参考菌株和MDR菌株保持抗菌活性。在离体或体内创面模型中的验证，以及对蜂蜜基质的成分表征，是向临床可用制剂迈进的下一步。