新型海葵肽Ed-79阻断Shaker Kvv通道及其杀虫活性研究

《Molecules》：A Novel Sea Anemone Peptide Ed-79 Blocks Shaker Kv Channels and Exhibits Insecticidal Activity

　　

农业害虫对传统化学杀虫剂抗性的不断攀升，催生了对具有新作用模式且环境友好型生物替代品的迫切需求。海葵毒液富含结构稳定且靶点特异的离子通道调制肽，是新型杀虫分子的有前景来源。研究人员通过对海葵Exaiptasia diaphana转录组数据库进行生物信息学筛查，鉴定出一个含三条二硫键的新型37残基肽Ed-79。该肽通过固相肽合成法（SPPS）化学合成，并采用三步氧化折叠策略成功折叠为正确二硫键连接形式，经液相色谱-质谱联用（LC-MS）和反相高效液相色谱（RP-HPLC）确认。圆二色（CD）光谱显示，氧化折叠后二级结构发生显著变化，尤其β-折叠含量增加。杀虫生物测定中，Ed-79对草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）和黄粉虫（Tenebrio molitor）表现出剂量依赖性致死活性，半数致死剂量（LD₅₀）分别为289.5和367.2 pmol/g。分子对接进一步预测，Ed-79通过八个氢键稳定结合至Shaker Kv通道孔道外前庭，Pro475和Asn482可能是关键相互作用残基。综上，这是关于Ed-79的合成、氧化折叠、杀虫活性及预测Shaker Kv通道结合模式的首次系统性报道，为开发新型杀虫先导化合物奠定坚实基础，并拓宽了海葵毒液作为杀虫剂资源的应用前景。

农业害虫对传统化学杀虫剂（如拟除虫菊酯、有机磷和新烟碱类）的抗性日益严重，导致防治效果显著下降，对全球粮食安全和生态可持续性构成重大威胁。动物毒液来源的神经活性肽具有新颖的作用机制，被认为是开发下一代绿色生物农药的关键策略。海葵Exaiptasia diaphana属于最古老刺胞动物谱系之一，其刺细胞产生的毒液富含结构稳定、靶点特异的离子通道调节肽。在众多靶点中，电压门控钾通道（voltage-gated potassium channel, Kv）尤其是Shaker家族通道，因在昆虫神经元兴奋性、神经递质释放和肌肉收缩中发挥核心作用，成为杀虫肽的理想靶点。然而，与蝎子和蜘蛛毒液研究相比，海葵源杀虫肽的系统研究仍相对有限，尤其缺乏整合组学发现、合成优化与功能验证的系统工作流程。因此，研究人员基于本实验室已建立的E. diaphana转录组数据库，通过生物信息学筛选及分子对接分析，鉴定出一个含三条二硫键的新型37残基肽Ed-79，并系统开展其化学合成、氧化折叠、杀虫活性及与Shaker Kv通道结合模式的研究。研究结果表明，Ed-79经三步氧化折叠后获得正确二硫键连接，对草地贪夜蛾（S. frugiperda）和黄粉虫（T. molitor）具有剂量依赖性致死活性，分子对接预测其通过多个氢键稳定结合于Shaker Kv通道孔道外前庭。该工作为开发新型杀虫先导化合物提供了基础，同时拓展了海葵毒液作为杀虫剂资源的应用价值。

为开展本研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：以本实验室已建立的E. diaphana转录组数据库为样本来源，经保守半胱氨酸框架筛选、信号肽预测和功能基序分析获得Ed-79序列；利用固相肽合成法（SPPS）合成线性肽；采用含正交保护基（Acm、tBu）的三步氧化折叠策略形成特异性二硫键（C1–C6、C2–C4、C3–C5）；通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）监控折叠过程；使用圆二色（CD）光谱表征二级结构变化；采用注射生测法测定杀虫活性；利用AlphaFold3进行三维结构预测，并通过ZDOCK/RDOCK算法将Ed-79与Shaker Kv通道（PDB ID: 7SIP）进行分子对接。

研究结果如下。
2.1 同源比对和三维结构预测
研究人员从文献中选取六个已知可阻断Shaker Kv通道或具有杀虫活性的ShK家族肽作为查询序列，对E. diaphana转录组数据库进行同源筛选，获得新型37残基肽Ed-79。WebLogo和Jalview多序列比对显示，Ed-79与同源肽共享严格保守的半胱氨酸框架，六个半胱氨酸位置完全保守，预测形成C1–C6、C2–C4、C3–C5三对二硫键；在对应Shaker Kv通道结合表面的环区（残基20–29），Ed-79保留了ShK家族通道阻断肽的功能二联体关键残基。AlphaFold3预测表明，Ed-79及其六个同源肽均采用保守的ShK折叠，即由三条二硫键稳定的紧凑β-折叠核心结构。
2.2 化学合成和顺序氧化折叠
Ed-79的线性前体经SPPS合成并纯化，其相对分子质量为4259.10 Da，与理论值一致。三步氧化过程中，相对分子质量和RP-HPLC保留时间呈预期变化：第一步形成第一个二硫键（-2 Da）；第二步脱除两个Acm基团并形成第二个二硫键（-144 Da）；第三步脱除两个tBu基团并形成第三个二硫键（-114 Da），最终相对分子质量为3999.08 Da，与理论值相符，证实三条二硫键正确配对。
2.3 圆二色光谱分析
CD光谱监测显示，随着三步氧化进行，Ed-79的二级结构发生显著变化。与线性肽相比，完全氧化后的Ed-79 α-螺旋含量降低，β-折叠含量增加，表明氧化折叠使肽趋于更紧凑、富含β-折叠的构象。
2.4 Ed-79对草地贪夜蛾和黄粉虫的杀虫活性
将Ed-79注射至幼虫下腹部（浓度2.5–20 μM），结果显示Ed-79对S. frugiperda和T. molitor均表现出剂量依赖性致死效应，空白和阴性对照组无死亡。最高浓度（20 μM）导致显著死亡，最低浓度（2.5 μM）无显著效果。通过非线性回归拟合剂量-反应曲线，Ed-79对两种昆虫的半数致死剂量LD₅₀分别为289.5 pmol/g和367.2 pmol/g。
2.5 Ed-79与Shaker Kv通道的分子对接
利用Discovery Studio 2023进行刚性对接（ZDOCK）和能量优化（RDOCK），预测Ed-79稳定结合于Shaker Kv通道（PDB ID: 7SIP）孔道外前庭，与周围残基形成八个氢键。其中通道残基Pro475与Ed-79的Ser10、Tyr6、Ser23形成三个氢键（2.1–2.5 ?），Asn482与Ala13、Thr27、Arg21形成三个氢键（2.1–2.3 ?），Tyr483与Arg3形成一个氢键（2.4 ?），Ser479与Lys26形成一个氢键（2.3 ?）。所有氢键距离均在2.1–2.5 ?范围内，提示强氢键相互作用。Pro475和Asn482是参与结合最频繁的残基，可能为关键相互作用残基。该结合模式与孔道阻断型钾通道抑制剂的作用机制一致，提示Ed-79可能作为Shaker Kv通道阻断剂，但尚需电生理实验直接验证。

讨论部分总结如下：Ed-79的正确二硫键连接与β-折叠含量的增加，符合富含二硫键离子通道调节肽的结构特征，是其生物活性构象和靶标识别的基础。注射生测得到的LD₅₀值与文献中其他注射给药杀虫毒肽相近，但口服等其他给药途径的活性未知。Shaker Kv通道在昆虫中高度保守，其选择性滤过特征序列TMTTVGYG在鳞翅目和鞘翅目中一致，是合理的杀虫剂靶标。分子对接揭示了Ed-79通过广泛氢键网络结合孔道区的机制，类似于经典钾通道阻断剂Tityustoxin-Kα的作用方式，但该预测仍需电生理记录确证。研究局限性包括：仅通过注射评价杀虫活性，未评价经口给药效果；未进行膜片钳或双电极电压钳实验验证通道阻断功能。研究结论翻译如下：本研究首次系统报道了来自海葵E. diaphana转录组的新型三对二硫键37氨基酸肽Ed-79，通过SPPS和三步氧化折叠成功获得二硫键正确配对的生物活性肽，CD光谱证实折叠后β-折叠含量增加。室内杀虫测定显示Ed-79对S. frugiperda和T. molitor具有剂量依赖性致死效应，LD₅₀分别为289.5和367.2 pmol/g。分子 docking预测Ed-79通过八个氢键稳定结合于Shaker Kv通道孔道外前庭，Pro475和Asn482可能为关键相互作用残基。该工作为开发新型绿色杀虫先导化合物奠定基础，并拓展了对海葵毒液作为杀虫剂资源价值的认识；但Ed-79的通道阻断活性仍需电生理实验验证。