生物活性导向分离两种毛蕊花属植物细胞保护代谢物及其对香烟烟雾提取物诱导支气管上皮炎症与氧化应激的差异调控

《Molecules》：Bioactivity-Guided Isolation of Cytoprotective Metabolites from Two Verbascum Species Reveals Differential Modulation of Cigarette Smoke-Induced Inflammation and Oxidative Stress

　　

毛蕊花属（Verbascum）植物传统上用于呼吸系统疾病，是环烯醚萜苷（iridoid glycosides）、苯乙醇苷（phenylethanoid glycosides）和三萜皂苷（triterpenoid saponins）的丰富来源。然而，V. kurdicum和V. longipedicellatum此前尚未进行植物化学或生物学研究。本研究旨在鉴定其生物活性成分，并表征其对香烟烟雾提取物（CSE，cigarette smoke extract）诱导的支气管上皮损伤的保护作用。对50%甲醇提取物进行生物活性导向分离，获得12个经核磁共振（NMR，nuclear magnetic resonance）鉴定的化合物。在BEAS-2B（人支气管上皮细胞系）细胞中评估细胞保护潜力，并对所选化合物考察其对白细胞介素-6（IL-6，interleukin-6）、白细胞介素-8（IL-8，interleukin-8）、血红素加氧酶-1（HO-1，heme oxygenase-1）、Toll样受体4（TLR4，Toll-like receptor 4）表达及下游效应分子（MyD88，myeloid differentiation primary response 88；NF-κB，nuclear factor-kappa B）、谷胱甘肽（GSH，glutathione）、8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG，8-hydroxy-2′-deoxyguanosine）水平和超氧化物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）活性的影响。Ajugol表现出最强的细胞保护活性，并在CSE暴露后显著恢复细胞活力。选取ajugol、aucubin和1-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose进行机制评价。Aucubin和1-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose显著降低CSE诱导的IL-6释放，而三者均抑制IL-8，其中ajugol作用最强。Ajugol还减轻TLR4上调，降低8-OHdG水平及CSE诱导的SOD活性升高，而MyD88、总NF-κB、p-NF-κB^Ser536和GSH未见显著改善。这些发现首次提供两个物种的植物化学和生物学表征，并确定ajugol作为对抗CSE诱导支气管上皮损伤的有前景先导化合物。

香烟烟雾（cigarette smoke，CS）可诱导呼吸道上皮氧化应激、炎症信号和细胞损伤，支气管上皮细胞是吸入毒物的主要屏障并主动释放细胞因子和趋化因子参与肺部免疫反应。CSE（cigarette smoke extract，香烟烟雾提取物）模型可用于研究早期上皮反应。既往对毛蕊花属（Verbascum）的研究多集中于抗肿瘤筛选或单个化合物在哮喘、急性肺损伤中的评价，尚无研究在CS诱导肺损伤模型中评价该属提取物或其分离的环烯醚萜苷、皂苷和苯乙醇苷的保护或抗炎潜力；V. kurdicum和V. longipedicellatum在植物化学和生物学上均未被研究，且尚无生物活性导向研究将其化学成分与CSE诱导支气管上皮损伤保护作用相联系。因此，研究人员开展本研究，旨在鉴定两种植物的活性成分并表征其对CSE诱导BEAS-2B（人支气管上皮细胞系）损伤的细胞保护、抗炎和抗氧化作用，为CS相关气道损伤提供候选先导化合物。

关键技术方法（≤250字）：植物地上部分于2022年7月采自Türkiye Batman省Sason的Dikbay?r高原（V. kurdicum，D?rtb?lük村）和Tinget高原（V. longipedicellatum，Sar?yayla村），由Yeter Ye?il Cantürk鉴定，凭证号分别为ISTE117826和ISTE117827。研究人员以50%甲醇提取，经n-己烷和n-丁醇分配，采用聚酰胺柱、真空液相色谱（VLC）、Sephadex LH-20、硅胶柱和RP-18中压液相色谱（MPLC）进行生物活性导向分离，经1D/2D NMR及文献比对鉴定结构。生物学评价采用CSE诱导BEAS-2B损伤模型，以MTT法测细胞活力，ELISA测IL-6、IL-8、HO-1和MMP-9，Western blot测TLR4、MyD88、总NF-κB和p-NF-κB^Ser536，并测GSH、8-OHdG和SOD。

研究结果：2.1 生物活性导向筛选活性部位：研究人员以BEAS-2B细胞活力筛选两种植物提取物及部位，确定VK1A和VL1E为主要细胞保护部位；VK1A还显著降低CSE诱导的IL-6释放，VL1E主要依据细胞保护活性入选。2.2 生物活性导向分离与结构鉴定：对VK1A和VL1E进行色谱分离，经1D/2D NMR和与既往光谱数据比较，共鉴定12个化合物；VL1E得4个，VK1A得8个，包括环烯醚萜苷、三萜皂苷、苯乙醇苷和核苷等。2.3 细胞毒性与细胞保护作用：先测12个化合物细胞毒性以确定非毒浓度，再在CSE损伤模型测活力；CSE使细胞活力降至42.3%，ajugol、aucubin和1-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose活力最高，分别达69.3%、62.1%和58.8%，仅ajugol差异有统计学意义（p<0.01），三者进入机制评价。2.4 对CSE诱导炎症反应的影响：CSE显著增加IL-6、IL-8和HO-1；1-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose和aucubin显著降低IL-6，三者均显著抑制IL-8且ajugol作用最强，三者均降低HO-1；MMP-9在4 h CSE暴露下未显著升高，无法评价化合物对其抑制。2.5 对TLR4表达及下游介质的影响：CSE显著增加TLR4；ajugol显著降低TLR4，而aucubin和1-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose无显著作用；MyD88、总NF-κB和p-NF-κB^Ser536在各组无显著差异，不能证明完整经典TLR4/MyD88/NF-κB通路被抑制，ajugol作用更似选择性调节TLR4。2.6 对CSE诱导氧化应激的影响：CSE显著降低GSH、升高8-OHdG和SOD活性；三种化合物均未恢复GSH；ajugol显著降低8-OHdG并降低SOD活性，aucubin降低SOD但8-OHdG未达显著，1-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose未降低8-OHdG且SOD仍高；ajugol对氧化DNA损伤保护最明显。

讨论总结：研究人员指出BEAS-2B为初步筛选模型，不能代表原代细胞、慢性暴露和临床疗效；两活性部位成分差异明显，保护作用不能均匀归因于所有成分；ajugol总体保护最突出，aucubin和1-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose炎症谱不同；HO-1降低不能独立视为细胞保护，可能反映上游氧化应激减轻；aucubin与既往Nrf2/HO-1结果方向不同，可能受模型、暴露条件、浓度和取样时间影响；MMP-9无响应与4 h急性暴露有关；TLR4升高与既往一致，ajugol降低TLR4并强抑制IL-8，但MyD88和NF-κB磷酸化未显著，不能证明完整通路抑制，TRIF依赖信号未研究；GSH未恢复但8-OHdG降低，SOD变化需结合其他氧化指标；需时间依赖信号研究、直接测细胞内ROS、NF-κB核转位、MyD88非依赖TLR4信号、重复或慢性暴露模型、原代细胞、3D模型及体内验证。

研究结论部分翻译：本研究首次对V. kurdicum和V. longipedicellatum进行综合植物化学和初步生物学研究，并在CSE诱导的急性支气管上皮损伤模型中将化学成分与细胞保护活性相联系。生物活性导向分离确定VK1A和VL1E为主要活性部位，并分离出12个结构表征的化合物，代表多个天然产物类别。比较生物学筛选进一步确定ajugol、aucubin和1-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose具有最突出活性谱。三个化合物显示明显不同的生物效应。Aucubin和1-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose优先抑制CSE诱导的IL-6释放，而ajugol对IL-8作用尤为显著，并在CSE暴露BEAS-2B模型中调节TLR4表达，而非提供完整抑制整个TLR4/MyD88/NF-κB通路的证据。Ajugol还对氧化DNA损伤提供最清晰保护，在GSH未恢复情况下显著降低8-OHdG。结合其显著细胞保护活性和对CSE诱导SOD反应的调节，这些发现确定ajugol为所分离代谢物中保护谱最广的化合物。重要的是，MyD88和NF-κB磷酸化无显著变化，以及GSH、SOD和8-OHdG之间的分歧反应，表明保护效应不能归因于单一经典炎症或氧化通路；结果提示化合物特异性及可能的多靶点机制，尚需进一步阐明。需要时间依赖信号研究、直接测细胞内ROS、评估NF-κB核转位和MyD88非依赖TLR4信号，并在慢性或重复暴露体外模型和先进三维肺系统中验证，以进一步阐明机制；随后可考虑适当论证的体内研究评价药理相关性。总体而言，这些发现表明此前未开发的Verbascum物种是生物活性次生代谢物的有价值来源，并为进一步研究ajugol和aucubin在CS相关炎症性和氧化性肺损伤中的作用提供依据。