大麻二酚对离子载体类抗球虫药致猫与犬肾细胞毒性的差异性调控：一项体外研究

《Molecules》：Cytotoxic Interactions Between Cannabidiol and Ionophore Coccidiostats in Feline and Canine Kidney Cell Lines—An In Vitro Study

　　

在动物生产中使用离子载体类球虫抑制剂（ionophore coccidiostats）——盐霉素（SAL）、拉沙洛西（LAS）、莫能菌素（MON）和那拉霉素（NAR）——因饲料污染及其狭窄安全范围，引起非靶标物种的毒性担忧。大麻二酚（CBD）具有抗氧化和细胞保护特性，可能改变细胞对离子载体诱导毒性的反应。本研究在猫肾细胞（CRFK）和犬肾细胞（MDCK）中考察CBD对SAL、LAS、MON和NAR细胞毒性的影响。细胞暴露于每种球虫抑制剂72 h，单独或与CBD联合，并采用线粒体活性（MTT）、溶酶体活性（NRU）、总蛋白含量（TPC）和膜完整性（LDH）试验评估；通过等效线图分析（isobolographic analysis）评估相互作用。研究在AutoDock Vina 1.2.7中进行CBD和离子载体与人电压依赖性阴离子通道1（VDAC1；PDB 6TIQ）的分子对接，分别单独及同时多配体组合，以β-NADH、VBIT-4和SW016789为参考配体。四种离子载体均诱导浓度依赖性细胞毒性，CRFK和MDCK细胞间呈现不同的化合物和物种特异性特征。CBD共暴露产生取决于药物和细胞模型的分歧性相互作用，从明显细胞保护到显著协同增强毒性，尤其在犬细胞中对SAL和LAS最显著。离子载体占据N端螺旋，CBD占据部分重叠的C端区域，β-NADH可将其置换，提示所观察相互作用的可能结构基础。这些发现表明离子载体肾毒性潜力及其受CBD调节均呈浓度和物种依赖性，值得使用更多体外和体内模型进一步研究。

研究背景：食品和饲料污染物是保障人与动物（包括犬、猫等伴侣动物）健康安全的重要挑战。食用动物饲料的官方监测可发现并降低既有危害，但全球伴侣动物宠物食品的官方监管仍需更严格和协调，以防止兽药、金属、农药等污染。离子载体类抗球虫药（ionophore coccidiostats，可促进离子跨膜转运的抗球虫药）用于食用动物，安全范围窄，易通过饲料污染使非靶标动物中毒。文献已报告犬猫球虫抑制剂中毒病例，临床以心肌和骨骼肌毒性（肌变性、横纹肌溶解）最常见，肾功能障碍也可直接发生或继发于肌肉损伤；可见多尿后少尿和肾衰竭，组织病理包括双侧肾髓质坏死、纤维化、肾小管和肾小球矿化、肾单位丧失、髓质瘢痕，并伴肾内药物高浓度。其机制涉及Na⁺、K⁺、Ca²⁺、H⁺内流，导致线粒体肿胀、膜电位丧失和ATP水平下降。CBD为非精神活性植物大麻素，具抗氧化、抗炎、调节离子平衡、抗凋亡和细胞保护作用，且已有对药物性肾病及HEK-293细胞中球虫抑制剂细胞毒性的研究；但评估犬猫相互作用需物种特异性细胞模型。因此，研究人员在猫CRFK和犬MDCK肾细胞中考察四种球虫抑制剂单独及与CBD联合的细胞毒性，并用分子对接探讨VDAC1（电压依赖性阴离子通道1）结构基础。研究人员开展的研究得出：四种药物肾毒性与CBD调节均呈化合物、浓度和物种依赖，犬细胞中SAL和LAS可被CBD强烈协同增毒。其意义在于提示亚临床肾细胞损伤可能早于体内组织病理和生化改变，支持该体外模型作为敏感筛查工具。

方法概述（≤250字）：研究使用ATCC来源的猫肾CRFK（ATCC CCL-94）和犬肾MDCK（ATCC CCL-34）细胞系；以1、5、10、50 μg/mL的SAL、LAS、MON、NAR单独或与1.56 μg/mL CBD联合暴露72 h，采用MTT、NRU、TPC和LDH试验分别评估线粒体活性、溶酶体活性、总蛋白含量和膜完整性；计算半数抑制浓度（IC₅₀），按Chou-Talalay中效方程和联合指数（CI）判定协同、相加或拮抗；并以人VDAC1（PDB 6TIQ）为受体，在AutoDock Vina 1.2.7中对CBD和离子载体单独及同时多配体对接，设β-NADH、VBIT-4、SW016789为参考配体，三独立随机种子重复。

研究结果：
2.1 大麻二酚在猫肾（CRFK）和犬肾（MDCK）细胞中的作用：通过CBD单独暴露及四终点试验得出，CBD并非惰性；CRFK中NRU和TPC受抑、MTT仅高浓度下降、LDH释放低，MDCK中低浓度轻度提高MTT和TPC、仅高浓度抑制NRU和TPC，提示其内在活性呈物种和终点依赖。
2.2 盐霉素及其与CBD相互作用：通过SAL单独/联合四试验和CI分析得出，CRFK中SAL抑制线粒体和溶酶体活性，CBD提高所需浓度，IC₅₀在MTT低于NRU且混合物IC₅₀升高，CI以相加为主、高浓度部分协同；MDCK中SAL从1 μg/mL抑制溶酶体，CBD共处理在1 μg/mL即降低溶酶体、线粒体和增殖，混合物IC₅₀更低，CI示协同。
2.3 拉沙洛西及其与CBD相互作用：通过LAS单独/联合四试验和CI分析得出，CRFK中LAS抑制溶酶体和线粒体活性，CBD提高所需浓度，IC₅₀仅在MTT获得，CI示NRU、TPC、LDH拮抗、50 μg/mL MTT相加；MDCK中LAS抑制增殖及线粒体/溶酶体活性，CBD在1 μg/mL降低溶酶体，TPC的混合物IC₅₀约低7倍，CI示MTT和TPC低浓度相加、较高浓度协同，NRU和LDH轻度协同。
2.4 莫能菌素及其与CBD相互作用：通过MON单独/联合四试验和CI分析得出，CRFK中MON抑制线粒体和溶酶体活性，CBD提高线粒体和增殖活性、降低膜损伤，IC₅₀仅NRU获得，CI示MTT、TPC、LDH拮抗、NRU相加；MDCK中MON先抑制溶酶体后抑制线粒体，与CRFK敏感性顺序相反，CBD提高所有参数，NRU的IC₅₀约为CRFK的3倍，CI示MTT和TPC拮抗、NRU低浓度拮抗高浓度相加、LDH相加且不依赖浓度。
2.5 那拉霉素及其与CBD相互作用：通过NAR单独/联合四试验和CI分析得出，CRFK中NAR抑制线粒体和溶酶体活性，CBD低浓度提高线粒体活性、50 μg/mL降低，并提高溶酶体和增殖、降低膜损伤，IC₅₀以NRU最低，NAR+CBD在MTT获有限IC₅₀而NAR单独无，CI示MTT拮抗且高浓度协同、NRU相加、TPC临界相加/拮抗、LDH拮抗；MDCK中NAR先抑制溶酶体和增殖、后抑制线粒体，CBD提高所有参数，NAR单独MTT的IC₅₀约为混合物的1/7，CI示MTT和TPC拮抗、NRU低浓度拮抗高浓度相加、LDH相加且不依赖浓度。
2.6 CBD–球虫抑制剂相互作用总结：通过汇总两细胞系四终点CI得出，CRFK以拮抗或相加为主，CBD提高多数终点所需药物浓度，协同仅见最高浓度（SAL和NAR的MTT、SAL的LDH）；MDCK呈化合物依赖，SAL和LAS在多数终点被CBD增强，MON和NAR保留拮抗；多数浓度依赖组合由低浓度拮抗/相加转向高浓度相加/协同，例外为CRFK中SAL的NRU仅5 μg/mL拮抗、MDCK中LAS的NRU在1–10 μg/mL协同而50 μg/mL临界。
2.7 分子对接结果：2.7.1 单独配体筛选：通过AutoDock Vina单独对接得出，四种离子载体预测亲和力为?8.24至?7.79 kcal/mol，CBD较弱（?6.79±0.16 kcal/mol），参考配体β-NADH（?8.93±0.16）、VBIT-4（?8.14±0.29）、SW016789（?7.73±0.04）处于相近范围；离子载体同时接触N端α-螺旋（残基5–19）和C端β₁₅–β₁₈，均与β₁的Lys28疏水作用，三者与N端螺旋形成氢键；CBD六个相互作用中五个位于C端半部（Ala205、Ala222、Ser234、Lys236、Leu262），仅Val17位于N端，以疏水作用为主、仅一个氢键与Ser234；CBD位点与β-NADH在Ser234、Lys236和β₁₈重叠，与离子载体N端区域仅部分重叠。2.7.2 同时分子共对接：通过CBD与各离子载体及β-NADH同时多配体对接得出，所有CBD–离子载体复合物评分均低于各自单独评分之和，配体效率下降，提示相互干扰而非协同结合；离子载体保留或增强N端螺旋和β₁结合，CBD–β-NADH中β-NADH保留原结合模式并将CBD置换至Tyr22、Phe24、Leu26、Lys53、Thr55口袋，CBD–LAS亦见相同重定位。2.7.3 五配体竞争：通过四离子载体有无CBD同时对接得出，无CBD时四配体评分?11.49±0.74 kcal/mol（单独之和?32.33），加CBD后五配体?12.53±0.16（单独之和?39.12），配体效率0.059与0.057；CBD加入已饱和四离子载体仅提高1.04 kcal/mol，约为其单独?6.79 kcal/mol的15%且无配体效率增益；无CBD时也发生配体从主口袋向外周表面位移，提示拥挤主要源于离子载体自身而非CBD。

讨论与结论：作者指出CBD在1.56 μg/mL并非惰性：CRFK中抑制溶酶体活性和总蛋白含量，MDCK中轻度提高线粒体活性和总蛋白含量，其内在活性呈物种和终点依赖，并参与组合结果差异。CRFK中SAL主要抑制线粒体，CBD提高IC₅₀，低浓度呈部分保护而高浓度转为相加/协同；MON和NAR以溶酶体为主要靶标且IC₅₀低，CBD与二者在溶酶体终点多为相加，但对NAR线粒体损伤增敏；LAS毒性最弱，CBD呈拮抗保护。MDCK中SAL单独毒性较低，但CBD产生显著协同增强，作者联系离子载体破坏K⁺转运、继发Ca²⁺内流、线粒体肿胀、膜电位崩溃和ROS（活性氧）升高，并认为CBD调节细胞内Ca²⁺可能参与钙超载；LAS在犬细胞中亦被CBD强烈协同增强，与文献报道犬LAS中毒低口服LD₅₀相符；MON在犬细胞抑制溶酶体约比猫弱3倍，NAR强抑制犬线粒体而CBD保护该终点。所有条件均未达到LDH的IC₅₀，提示相互作用发生在细胞内而未伴质膜完整性丧失。对接显示两类化合物在VDAC1上部分重叠，共享3个残基并各有独占位点，预期为混合竞争/非竞争；共对接低于单独之和与CRFK中拮抗一致，但不能解释MDCK中SAL和LAS的增强，作者认为钙超载机制更可能。CBD化学性质不同于离子载体，不能螯合阳离子或作为离子载体，其高亲脂、低极性表面积符合疏水驱动的膜分配结合。犬猫VDAC1仅残基13不同（犬Ser、猫Cys），该位点位于N端α-螺旋且为注释磷酸化位点，猫失去羟基并获得可被ROS氧化的硫醇；作者将其作为比对产生的可检验假设而非已证明机制。多终点物种特异细胞系具判别力，长期暴露组织病理可早于血尿素氮/肌酐等常规标志物。局限性包括体外细胞系不能完全反映体内、浓度和终点有限、CBD稳定性与代谢未测、1.56 μg/mL为游离浓度上限、MDCK缺乏SLC22/SLCO转运体且CRFK为成纤维样、计算采用无膜受体和单刚体姿态、多配体评分为复合值不可直接比较。结论翻译：盐霉素、拉沙洛西、莫能菌素和那拉霉素的肾毒性潜力在猫（CRFK）和犬（MDCK）肾细胞系间存在差异；大麻二酚以分歧方式调节这些效应，在猫细胞中对多数化合物呈保护作用，而在犬细胞中强烈增强盐霉素和拉沙洛西的毒性；分子对接支持VDAC1作为结构上可能的共同靶点，犬猫通道在N端螺旋一个注释磷酸化位点上的单个氨基酸差异为该物种依赖性提供了具体且可检验的假设；这些发现表明肾细胞亚临床损伤可能早于体内组织病理和生化改变，支持本研究所用体外模型作为敏感筛查工具的价值。