肝细胞癌免疫治疗中的免疫与循环生物标志物：预后价值与治疗反应关联的系统性综述

《Cancers》：Extracellular Vesicles Derived from L-MYC Neural Stem Cells Mediate Neuroprotection in 3D Models of Chemotherapy- and Radiation-Induced Neurotoxicity

　　

肝细胞癌（HCC）是癌症相关死亡的主要原因。基于免疫检查点抑制剂（ICI）的联合治疗已成为标准一线全身治疗，但客观缓解率仍然有限（20%–36%），且尚无针对HCC的特异性免疫生物标志物被验证可用于指导标准ICI方案的选择。本综述探讨了HCC中潜在免疫生物标志物的预后及探索性治疗反应关联，包括肿瘤微环境（TME）和外周血中的标志物。研究人员开展了一项叙述性综述，评估了PD-L1及可溶性PD-L1、肿瘤突变负荷（TMB）、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）（包括基于机器学习的评估）、基因表达谱及肿瘤内在通路改变、长链非编码RNA、炎症标志物（中性粒细胞与淋巴细胞比值、血小板与淋巴细胞比值、甲胎蛋白）、肠道微生物群以及液体活检分析物（循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞、游离细胞DNA）。PD-L1表达显示出预后关联，但与ICI结局的关联不一致；检测方法间的异质性进一步限制了其应用，当前指南不推荐常规PD-L1检测。HCC中TMB普遍较低，与ICI反应的关联不一致。高密度CD8+ TIL与切除术后生存改善及探索性ICI治疗队列中的良好结局相关，但未经证实的治疗选择性价值。炎症基因特征及WNT/β-catenin通路激活与ICI结局相关。肠道微生物群特征与抗PD-1结局存在探索性关联，但小规模数据集间一致性有限。液体活检标志物，尤其是ctDNA，在复发预测和治疗监测方面显示出前景，但缺乏检测标准化。多种免疫生物标志物在HCC中具有预后价值，以高CD8+ T细胞浸润和炎症基因特征为特征的预先存在的免疫状态在探索性研究中与改善的ICI治疗结局相关。然而，这些探索性标志物尚未被验证可用于HCC方案间的常规选择。未来方向包括复合生物标志物 panel 的前瞻性验证、评估方法学的标准化以及人工智能在TME表征中的整合。

论文主体内容总结

1. 引言

肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一。一线全身治疗已转向以免疫治疗为基础的联合方案。IMbrave150试验中，阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗较索拉非尼改善生存，客观缓解率（ORR）约30%。HIMALAYA试验显示度伐利尤单抗联合曲美木单抗将中位总生存期（OS）提升至16.4个月。CheckMate-9DW试验中，纳武利尤单抗联合伊匹木单抗的中位OS为23.7个月，ORR为36%。尽管免疫治疗已纳入标准方案，但客观缓解率仍有限，原发性和获得性耐药导致约三分之二的患者无法获得客观缓解。原发性耐药由肿瘤内在因素驱动，包括低肿瘤抗原性或新抗原负荷、主要组织相容性复合体I类（MHC-I）缺陷、异常肿瘤细胞信号通路、肿瘤来源外泌体和代谢重编程。肿瘤外在通路包括T细胞功能障碍及调节性T细胞（Tregs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）等免疫抑制细胞。获得性耐药可能涉及异质性肿瘤群体中耐药克隆的选择和治疗相关的体细胞改变演化。HCC的主要病因包括酒精相关肝病（ALD）、代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）、病毒性肝炎等，这些疾病促进慢性肝脏炎症并形成免疫抑制性TME。HCC的TME主要由免疫抑制细胞群组成，形成免疫耐受环境。TME的免疫特征包括PD-L1表达、CD8⁺ T细胞密度和多样性以及炎症细胞因子通路。肠道微生物群组成与ICI治疗反应相关，应答者表现出更大的微生物丰富度和特定细菌类群的富集。

2. 潜在免疫和循环生物标志物

2.1 PD-L1

PD-L1是免疫检查点配体，通过结合T细胞上的PD-1受体调节免疫反应。一项217例HCC患者的研究发现17%的肿瘤细胞表达PD-L1，PD-L1表达与肿瘤侵袭性显著相关。在Caris Life Sciences的1306例肝脏恶性肿瘤样本分析中，PD-L1高表达占6.1%，低表达占11.6%，且PD-L1表达不影响ICI治疗持续时间。CheckMate 040试验分析显示，接受纳武利尤单抗治疗的患者中，PD-L1阳性亚组的缓解率和OS高于阴性亚组，但PD-L1阴性患者中也观察到完全缓解和部分缓解。KEYNOTE-224试验评估了联合阳性评分（CPS）和肿瘤比例评分（TPS），CPS与更好的ORR相关，但与TPS不一致，可能由于PD-L1表达检测的显著检测间异质性。一项研究用5种不同PD-L1免疫组化（IHC）检测方法评估100例HCC标本，发现免疫细胞浸润中PD-L1表达的比例和强度存在显著检测间变异。基于这些不一致的结果，国家指南不推荐在HCC中进行常规PD-L1检测。

2.2 可溶性PD-L1/PD-1

可溶性PD-L1（sPD-L1）和可溶性PD-1（sPD-1）是外周血中检测的PD-L1配体和PD-1受体的循环形式。一项包含11项研究、超过1200例接受多种局部区域治疗的HCC患者的荟萃分析发现，高sPD-L1与更差的OS相关（HR = 2.46, 95% CI 1.74–3.49）。sPD-1与OS无显著关联。sPD-L1缺乏标准化参考水平是主要局限性之一。

2.3 肿瘤突变负荷

肿瘤突变负荷（TMB）指肿瘤基因组中体细胞突变的总数，以每兆碱基突变数表示。HCC的中位TMB较低，为4 mut/Mb。一项跨27种肿瘤类型的研究发现ORR与中位编码体细胞突变数之间存在强线性相关。TCGA分析将364例HCC患者分为低和高TMB组，高TMB与更差的预后相关。不同研究使用了不同的TMB-high定义（前20%或4.9 mut/Mb cutoff），突显了缺乏标准化的HCC特异性阈值。在GO30140和IMbrave150队列中，TMB与ORR的关联不一致，GO30140中TMB-high组ORR为56%对比TMB-low组35%，但IMbrave150中未验证该结果。一项回顾性研究中，TMB ≥ 5 mut/Mb的患者中位OS为59个月对比TMB < 5 mut/Mb的41个月，但置信区间极宽表明估计不精确。

2.4 肿瘤浸润免疫细胞

肿瘤浸润免疫细胞包括T淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞。一项包含3509例患者的21项回顾性研究荟萃分析发现，手术标本中高瘤内CD8⁺ TIL密度与改善的OS（HR = 0.676）和无病生存期（DFS）（HR = 0.712）相关。肿瘤边缘的高CD8⁺ TIL密度也与改善的OS相关。在CheckMate 040的纳武利尤单抗单药治疗分析中，基线样本中增加的CD3⁺和CD8⁺ TIL显示OS改善趋势，但未达统计学显著性。在GO30140和IMbrave150队列中，应答者（完全或部分缓解）的CD8⁺ T细胞、CD3⁺ T细胞和GZMB⁺CD3⁺ T细胞密度高于非应答者。一项曲美木单抗联合消融的研究中，12例可评估标本显示治疗后CD8⁺ T细胞较基线增加2倍，应答者的CD3⁺和CD8⁺ T细胞平均阳性像素计数百分比高于非应答者。围手术期ICI治疗的研究中，达到主要病理反应（MPR）的患者瘤内CD8⁺表达增幅显著大于非应答者。

2.4.6 机器学习与TILs

机器学习为基础的TIL评估使用人工智能算法测量免疫细胞浸润。Chen等人开发了自动化CD8⁺ TIL评分系统（ATLS-8），在514例肝切除患者的多中心回顾性研究中，高ATLS-8评分患者的5年OS优于低评分患者。Zhang等人使用人工神经网络算法评估353例早期HCC患者，TIL densityK50指标与改善的DFS相关。Scheiner等人使用监督机器学习算法评估102例接受阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗治疗的BCLC C期患者的预处理样本，ICI-high组OS显著优于ICI-low组。Kim等人的研究发现高肿瘤内皮细胞（TEC）密度与阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗队列中更长的无进展生存期（PFS）相关，而高瘤内TIL密度与抗PD-1单药队列中更长的PFS相关。

2.5 基因表达和改变

基因表达谱（GEPs）通过测序测量多个基因的RNA表达。CheckMate 040的探索性分析显示，由CD274、CD8A、LAG3和STAT1组成的炎症特征与改善的ORR和OS相关。在阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗治疗的分子相关分析中，预先存在的免疫状态（高CD274表达、T效应特征和瘤内CD8⁺ T细胞密度）与更好的临床结局相关，而血管生成、胆固醇稳态、胆汁酸代谢和Notch信号通路上调与缺乏反应相关。阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗反应特征（ABRS）高组较ABRS低组有PFS获益。

2.6 肿瘤内在通路

一项127例晚期HCC患者的前瞻性队列研究显示，激活的WNT/β-catenin信号与ICI治疗亚组中更低的疾病控制率（DCR）以及更短的PFS和中位OS相关。TP53改变与较少的CD8⁺ T细胞浸润相关。在IMbrave150和GO30140队列中，CTNNB1野生型和TERT突变肿瘤与阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗较索拉非尼的更大获益相关。

2.7 长链非编码RNA

长链非编码RNA（lncRNAs）是长度超过200个核苷酸的非编码转录本。一项跨33种癌症类型的生物信息学研究显示，MIR155HG高表达与浸润免疫细胞以及PD-L1和CTLA4显著相关。Zhang等人识别并验证了包含10个免疫相关lncRNAs的预后特征，该特征与疾病进展和更差的生存相关。Deng等人识别了5个与较差OS相关的枢纽lncRNAs（AC091057、AC099850、AC012073、DDX11-AS1和AL035461）。

2.8 炎症和肿瘤标志物

炎症促进肿瘤生长、血管生成和转移。中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）和血小板与淋巴细胞比值（PLR）是反映TME与全身免疫系统关系的指标。甲胎蛋白（AFP）主要由肝脏组织和卵黄囊内胚层产生，在HCC等病理条件下升高。NLR可能受全身感染、肝脏炎症和肝硬化严重程度影响，PLR可能受门静脉高压相关的血小板减少症混淆，AFP也可能在活动性肝炎、肝再生、纤维化和肝硬化中升高。

2.9 炎症标志物

CheckMate 040研究显示，最低NLR三分位患者的OS显著优于中或高三分位患者。PLR在治疗应答者中显著低于非应答者，较低PLR水平与改善的OS强相关。低AFP水平（<400 μg/L）患者的中位OS为16.8个月，高于高AFP水平（≥400 μg/L）患者的13.0个月。GALAD评分（结合性别、年龄、小扁豆凝集素反应性AFP（AFP-L3）、AFP和异常凝血酶原（DCP））和BALAD-2评分（胆红素、白蛋白、AFP、AFP-L3和DCP）在回顾性研究中与3个月治疗反应相关，但未建立作为ICI选择标志物的证据。

2.10 肠道微生物群

肠道微生物群与宿主免疫系统存在广泛而关键的相互作用。在慢性肝病中，肠道屏障的病理性改变增加通透性，促进微生物相关分子模式（MAMPs）通过门静脉转运至肝脏。脂多糖（LPS）激活Toll样受体4（TLR4），触发促肿瘤炎症。菌群失调导致的代谢改变导致次级胆汁酸积累，可增加DNA损伤并激活mTOR通路。多项因素可能混淆微生物组特征的解读，包括地理来源、饮食模式、药物暴露（特别是抗生素和质子泵抑制剂）、肝硬化本身以及潜在肝病病因。小规模观察性研究显示，抗PD-1治疗期间应答者表现出显著更高的物种丰富度和微生物基因数量。特定细菌物种如Akkermansia muciniphila和Ruminococcaceae spp.可增强抗肿瘤免疫。在一项混合肝胆队列中，高丰度的Lachnospiraceae bacterium GAM79和Alistipes sp. Marseille-P5997与更好的OS和PFS相关，而Veillonellaceae富集与更短的生存相关。一项8例接受纳武利尤单抗治疗的晚期HCC患者研究中，应答者表现出更高的Shannon指数，Akkermansia物种、Citrobacter freundii和Enterococcus durans与良好反应相关，而高水平的Escherichia coli、Enterococcus faecium和Veillonella与治疗失败相关。

2.11 液体活检

液体活检是一种微创诊断方法，分析血液或其他体液以检测分子改变、ctDNA、CTCs和cfDNA。cfDNA代表循环中细胞外DNA片段的总池，来源于恶性和非恶性细胞，而ctDNA代表cfDNA中肿瘤来源的部分。ctDNA在HCC诊断准确性方面优于AFP（敏感性85%对比60%，特异性92%对比80%）。一项38例患者的前瞻性研究显示，基线和治疗3个月时较高的cfDNA和ctDNA水平与生存降低和缺乏放射学反应相关。术后可检测ctDNA与更短的RFS（HR 4.48）和更差的OS（HR 2.99）相关。ctDNA检测的敏感性范围为33–82%，特异性为41–100%，突显检测性能的异质性。检测分子残留病（MRD）需要极高的分析敏感性和特异性。在HCC中，潜在慢性肝病可能因肝细胞损伤、炎症和肝硬化向cfDNA池贡献非肿瘤来源的DNA而混淆cfDNA解读。采集管类型、血浆分离时间、离心条件、储存和DNA提取方法等分析前变量可能影响cfDNA产量和下游ctDNA检测。

2.11.2 循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞（CTCs）是从原发肿瘤脱落进入循环系统的恶性细胞。CTCs的临床效用受限于其极低数量和可变持久性。EpCAM+ CTCs是研究较多的亚型，但仅20–52.5%的HCC肿瘤表达EpCAM，限制了该方法的适用性。

3. 未来方向

需要配对的组织分析（正常组织和肿瘤样本）以进一步表征免疫治疗的治疗效果。需要进一步优化PD-L1 IHC检测和基于基因表达特征的方法以实现临床实践应用。非侵入性液体活检方法将继续探索ctDNA、cfDNA和CTCs以提高检测敏感性。基于人工智能的方法正在HCC中兴起，用于分析基因组数据、开发风险预测模型和整合多模态数据。

4. 结论

本综述探讨了HCC独特的TME，并研究了潜在生物标志物的预后和治疗反应关联价值。PD-L1和TMB具有异质性的检测方法和不一致的ICI结局关联。高密度CD8⁺ T细胞与更好的PFS和OS相关。基因表达谱包括炎症基因特征与接受ICI患者的结局相关。CTNNB1突变与较少的ICI反应相关。NLR、PLR、AFP、微生物组特征和ctDNA可能提供预后或监测信息，但容易受到混杂因素和方法学异质性的影响。这些探索性标志物均未被验证可用于常规HCC ICI方案选择。本叙述性综述未采用预定义的系统检索策略、正式研究选择标准或偏倚风险评估。HCC的潜在病因导致TME内的异质性，可能影响免疫细胞浸润、免疫检查点表达和ICI反应。肝脏储备（通过Child–Pugh分级、白蛋白-胆红素（ALBI）分级评估）独立于肿瘤免疫影响生存和治疗耐受性，分析应分别调整这些领域。