《Macromol》：Encapsulation of Equisetum hyemale Extract in Immunomodulatory Collagen–Polyurethane–Dextran Semi-Interpenetrating Network Hydrogels Attenuates Cytotoxicity and Accelerates Diabetic Wound Healing
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木贼（Equisetum hyemale）提取物可促进糖尿病大鼠的创面愈合，但其细胞毒性限制了其应用。本研究旨在将该提取物封装于含20–30 wt%葡聚糖和20–40 wt%提取物的胶原-聚氨酯-葡聚糖半互穿网络（semi-IPN）水凝胶中。随后
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木贼（Equisetum hyemale）提取物可促进糖尿病大鼠的创面愈合，但其细胞毒性限制了其应用。本研究旨在将该提取物封装于含20–30 wt%葡聚糖和20–40 wt%提取物的胶原-聚氨酯-葡聚糖半互穿网络（semi-IPN）水凝胶中。随后评价了该水凝胶的理化性质、体外生物学响应及创面愈合性能。水凝胶表现出65–80%的交联度、2800–3100%的溶胀能力、以弹性为主导的行为，并在水解和蛋白水解条件下维持结构完整性长达30天。D20C20配方（20%葡聚糖和20%提取物）显示出最大的多酚渗透量（120 h后达940 μg/mL）和渗透系数（Kp = 9.9 × 10?3 cm/h）。细胞活力因配方、细胞类型和暴露时间而异。巨噬细胞和单核细胞在24 h后出现MTT衍生活力信号的短暂升高，随后在72 h后下降。然而，成纤维细胞活力在各配方间保持一致。大多数配方在脂多糖刺激的巨噬细胞中于72 h后增加了白细胞介素-10（IL-10）并降低了单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）。在测试条件下未观察到溶血或皮肤刺激。在糖尿病大鼠中，D20C20在第17天实现完全创面闭合。再生组织表现出更有序的胶原排列。这些发现支持进一步研究D20C20作为潜在创面愈合材料的可行性。
论文解读文章
一、研究背景与意义
慢性创面尤其是糖尿病足溃疡是临床面临的重大挑战，其愈合过程常因持续炎症、细胞外基质重塑障碍及易感染等因素而显著延迟。水凝胶因其三维亲水网络结构和良好的组织相容性，已成为创面敷料领域的研究热点。天然聚合物如胶原（collagen, COL）和葡聚糖（dextran, DEX）具有良好的生物相容性和生物降解性，但机械强度不足；而合成聚合物如聚氨酯（polyurethane, PU）则具有优异的力学性能。将天然与合成聚合物结合形成半互穿聚合物网络（semi-interpenetrating polymer network, semi-IPN），可在保持生物相容性的同时改善力学性能。
木贼（Equisetum hyemale）提取物含有丰富的酚类化合物如黄酮类，具有抗炎和促进创面愈合的活性，前期研究显示其局部应用可在14天内加速糖尿病大鼠创面愈合。然而，该提取物对RAW 264.7细胞和猪皮肤成纤维细胞表现出明显的细胞毒性，严重限制了其临床应用。因此，如何在不丧失其治疗功效的前提下降低提取物的细胞毒性，是推动其临床转化的关键问题。
本研究旨在将木贼提取物封装于胶原-聚氨酯-葡聚糖半互穿网络水凝胶中，探索该策略是否能在保留提取物促进创面愈合能力的同时改善其细胞相容性，为慢性创面管理提供一种兼具免疫调节功能和良好安全性的新型敷料平台。
二、研究设计与关键方法
研究人员采用微乳液法在4 °C条件下合成了四种不同配方的COL-PU-DEX-HYE水凝胶，即D20C20（20 wt%葡聚糖+20 wt%提取物）、D20C40、D30C20和D30C40。水凝胶以猪肌腱来源的I型胶原为基底，以甘油和六亚甲基二异氰酸酯（HDI）合成的聚氨酯为交联剂，通过引入葡聚糖和木贼提取物形成半互穿网络结构。
主要关键技术方法包括：采用浊度法测定凝胶化时间；采用茚三酮法测定交联度；通过广角X射线散射（WAXS）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征材料结构与化学组成；采用振荡流变学测定储能模量（G′）和损耗模量（G″）；通过热重分析（TGA）评估热稳定性；采用重量法测定溶胀度；在pH 4.5、pH 7.4及胶原酶条件下评价30天降解行为；利用Franz扩散池以猪皮肤为膜评价多酚透皮渗透性能；通过MTT法检测RAW 264.7细胞、人外周血单核细胞（PBMC）和猪皮肤成纤维细胞的活力；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量IL-10、TNF-α、TGF-β1和MCP-1等炎症介质；开展人红细胞溶血实验和兔皮肤刺激实验评价安全性；在链脲佐菌素-烟酰胺诱导的2型糖尿病Wistar大鼠模型（雄性，250–300 g，10–12周龄）上建立全层切除创面模型，每日局部给予水凝胶，动态记录创面收缩率，并在完全闭合后取材进行Masson三色染色组织学分析。
三、研究结果
3.1 水凝胶理化表征
四种配方水凝胶的交联度为65–80%，溶胀度为2800–3100%，凝胶化时间为3.7–5.5分钟。FTIR光谱显示了胶原、聚氨酯和葡聚糖的特征振动峰，但未能提供提取物与基质间相互作用的直接证据。WAXS图谱显示所有配方在约20°处存在宽弥散晕，在约31.5°处存在明确衍射峰，表明基质同时含有有序和无序区域。流变学分析表明所有配方的G′均大于G″，呈现以弹性为主导的类固体行为，其中D20C20和D30C40表现出较高的弹性响应。TGA分析显示水凝胶经历三个热降解阶段，含40 wt%提取物的配方有机质损失更大，而20 wt%葡聚糖配方在力学强度和热稳定性方面达到较优平衡。
3.2 降解行为
在pH 4.5、pH 7.4和胶原酶条件下，水凝胶初期质量下降20–40%，随后在10天内逐渐回升至原始质量的60–90%，并在30天内维持结构完整性。D20C20配方在模拟皮肤酸性环境和胶原酶蛋白水解环境中表现出最佳的降解稳定性。
3.3 多酚透皮渗透
D20C20配方在120 h时累积多酚渗透量最高，达940 μg/mL，渗透系数（Kp）为9.9 × 10?3 cm/h，滞后时间（Tlag）为6 h。D30C20的Kp为9.6 × 10?3 cm/h但Tlag延长至6.6 h。含40 wt%提取物的配方（D20C40和D30C40）渗透性能显著降低，其中D20C40呈现双相释放特征，存在初始突释风险。
3.4 细胞活力
直接暴露于水凝胶后，RAW 264.7细胞在24 h时MTT信号增加至对照的320–550%，但48 h和72 h后下降50–60%。水凝胶浸提液对PBMC也呈现类似的先增后降趋势。相比之下，猪皮肤成纤维细胞在各配方和各个时间点的活力均无显著差异。与游离提取物相比，封装于水凝胶基质中的提取物对细胞活力的抑制作用明显减弱。
3.5 炎症介质调节
在LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞中，72 h后大多数水凝胶配方将IL-10浓度提高至约800–1700 pg/mL（对照约400 pg/mL），同时将MCP-1维持在约1200 pg/mL（对照升高至约5000 pg/mL）。TGF-β1浓度在各组间无显著差异。TNF-α仅在24 h时被D20C20和D20C40显著降低。
3.6 安全性评价
四种水凝胶配方在兔皮肤刺激试验中72 h内均未引起红斑、水肿或焦痂形成。溶血率仅为0.1–0.3%，远低于阳性对照的100%，表明水凝胶具有良好的皮肤耐受性和血液相容性。
3.7 体内创面愈合
在2型糖尿病大鼠中，D20C20配方在第17天实现完全创面闭合，较其他配方（21天）提前4天，较未治疗糖尿病对照组（28天）提前11天。创面收缩率在7–17天期间较糖尿病对照组提高达40%。Masson三色染色显示D20C20和D20C40处理组的再生组织中胶原纤维排列更为有序和线性，而D30组胶原纤维排列较不规则。
四、讨论与结论
研究人员指出，将木贼提取物封装于COL-PU-DEX半互穿网络水凝胶中，通过控制释放机制有效减轻了游离提取物的细胞毒性，同时保留了其免疫调节功能。D20C20配方因较低的交联度（65%）和适度的基质-提取物相互作用，在降解稳定性、多酚渗透效率、力学性能和热稳定性之间实现了最优平衡，从而在体内展现出最快的创面闭合速度和更有序的胶原重塑。
研究结论认为，D20C20水凝胶通过促进IL-10分泌、抑制MCP-1表达，营造了有利于组织修复的免疫微环境，加速了糖尿病创面的愈合进程，再生组织呈现更有序的胶原排列。该配方被确定为具有前景的创面愈合候选材料。然而，研究人员也明确指出本研究的局限性：组织学样本采集时间点因各组愈合速度不同而存在差异；细胞因子浓度未按活细胞数进行归一化；免疫调节机制和创面组织中炎症介质、血管生成因子的直接证据尚缺乏；安全性评价仅限于短期单次暴露。未来需要采用固定时间点取材、直接检测创面组织中炎症和血管生成介质，并开展更全面的长期安全性评价，以进一步阐明其作用机制和临床转化潜力。
