多重耐药革兰阴性菌头孢地尔（FDC）药敏试验方法比较：纸片扩散法、梯度扩散法与肉汤微量稀释法

《Microorganisms》：Comparison of Disk Diffusion, Gradient Test Strips and Broth Microdilution for Cefiderocol Susceptibility Testing on Multidrug-Resistant Gram-Negative Organisms

　　

头孢地尔（FDC）是治疗多重耐药（MDR）革兰阴性菌所致感染的最后防线选择。然而，其药物敏感性试验在技术上要求较高：纸片扩散法（DD）已观察到性能不一，且梯度扩散法未被欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）认可作为肉汤微量稀释法（BMD）的替代方法。研究人员在铁缺乏阳离子调节Mueller–Hinton肉汤（ID-CAMHB）中，采用DD、梯度扩散法和参考BMD检测了205株分离株，包括肠杆菌目（n = 106）和非发酵菌（non-fermenters，n = 99），其中69株为产金属β-内酰胺酶（MBL）的肠杆菌目，并在可获得折点时采用EUCAST折点。在该菌株集合中，24.5%的肠杆菌目对FDC耐药。梯度扩散法与BMD的基本一致性（EA）总体为58.5%，且在全部较大亚组中均低于90%阈值。对于肠杆菌目，DD的分类一致性（CA）为64.2%，主要由46.3%的敏感分离株出现主要错误（ME）所驱动。梯度扩散法达到88.7% CA，但漏检8/26株耐药分离株（平均偏倚为?1.37 log₂稀释度）。在无临床折点的非发酵菌中，17.6%（12/68）的最低抑菌浓度（MIC） > 2 mg/L。相对于该界值，两种方法的一致性均超过90%，但DD和梯度扩散法分别未能检出这12株中的5株和3株。错误谱因菌群而异：DD在肠杆菌目中过度判读为耐药，但漏检高于EUCAST界值的非发酵菌；梯度扩散法则低估肠杆菌目的MIC。

研究背景与目的：头孢地尔（FDC）为铁载体头孢菌素，是多重耐药（MDR）革兰阴性菌感染的最后防线之一，对包括产金属β-内酰胺酶（MBL）菌株及固有MDR非发酵菌如S. maltophilia具有活性。但体外良好数据未完全转化为临床获益：CREDIBLE-CR试验中FDC组全因死亡率较高，主要由Acinetobacter spp.感染驱动；GAME CHANGER试验对产NDM肠杆菌目感染的FDC疗效提出担忧；新发耐药和异质性耐药报道进一步强调准确药物敏感性试验（AST）的重要性。FDC药敏检测独特困难：其活性依赖铁可利用度，参考肉汤微量稀释法（BMD）须在铁缺乏阳离子调节Mueller–Hinton肉汤（ID-CAMHB）中进行，制备繁琐、昂贵且难以标准化；商业BMD面板性能不一。纸片扩散法（DD）和梯度扩散法常规可用、资源消耗较低，但欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）目前不认可梯度法替代BMD，方法间差异常见，尤其MIC接近临床折点时。针对产NDM肠杆菌目及MDR革兰阴性菌在该范围内的数据仍较有限，而该人群替代治疗最受限、结局最难预测。因此，研究人员在MDR革兰阴性菌集合中比较DD、梯度扩散法与参考BMD的性能，并有意富集产NDM肠杆菌目。

关键技术与样本来源：菌株来自某三级大学医院菌种库的便利样本，该库保存常规诊断中的碳青霉烯耐药或产碳青霉烯酶革兰阴性菌及少量院内环境非发酵菌；纳入碳青霉烯耐药或产碳青霉烯酶的肠杆菌目、P. aeruginosa和A. baumannii，并有意富集产NDM肠杆菌目；共205株，肠杆菌目106株、非发酵菌99株，含69株产MBL肠杆菌目；除少数环境分离株外均为临床来源，每位患者仅1株。FDC药敏采用DD、梯度扩散法和参考BMD，每法双份；BMD在ID-CAMHB中进行；按可获得EUCAST折点判读，计算分类一致性（CA）、主要错误（ME）、极重大错误（VME）和基本一致性（EA），并以Bland–Altman分析log₂转换MIC的偏倚。

研究结果：3. Results（原文结果部分未设次级小标题，按原文段落归纳）。研究人员发现，全部205株的MIC₅₀和MIC₉₀分别为1 mg/L和4 mg/L。肠杆菌目BMD范围为≤0.016 mg/L至16 mg/L，MIC₅₀为1 mg/L、MIC₉₀为4 mg/L；75.5%（80/106）敏感、24.5%（26/106）耐药，E. coli和K. pneumoniae耐药比例分别为28.9%（11/38）和21.4%（6/28），但该比例反映菌株集合构成而非流行率。88株肠杆菌目检出碳青霉烯酶基因：69株携带MBL基因（60株单独，9株合并丝氨酸碳青霉烯酶基因），14株单独携带bla_OXA-48-like，5株单独携带bla_KPC；MBL中以bla_NDM为主（n = 64），bla_VIM 4株、bla_IMP 1株。携带MBL基因的肠杆菌目FDC MIC较高（MIC₅₀ 2 mg/L；MIC₉₀ 8 mg/L），36.2%（25/69）耐药；26株FDC耐药株中25株携带bla_NDM，但仅39.1%（25/64）的bla_NDM携带株耐药。42株无bla_NDM的肠杆菌目中，仅1株携带bla_OXA-48的M. morganii耐药，4株bla_VIM和1株bla_IMP均敏感。非发酵菌MIC₅₀和MIC₉₀分别为0.5 mg/L和4 mg/L，范围为0.064 mg/L至>64 mg/L；A. baumannii中28.9%（11/38）MIC > 2 mg/L（MIC₅₀ 1 mg/L，MIC₉₀ 16 mg/L），其他非发酵菌除1株S. maltophilia MIC为4 mg/L外均≤2 mg/L。A. baumannii中31/38检出碳青霉烯酶基因，以bla_OXA-23-like最多（n = 22），其次bla_OXA-58（n = 8），1株携带bla_NDM；11株MIC > 2 mg/L者中9株携带bla_OXA-23-like，但22株bla_OXA-23-like携带者中仅9株达到该MIC。P. aeruginosa中仅2株携带碳青霉烯酶基因（bla_VIM-1和bla_VIM-2）。总体上，肠杆菌目耐药几乎局限于bla_NDM携带株，A. baumannii获得性耐药主要但不完全见于bla_OXA-23-like携带株。

在方法学比较中，梯度扩散法与BMD的EA在全部205株中为58.5%，除P. fluorescens（100%，n = 5）外，所有较大亚组均低于90%阈值，范围从K. pneumoniae的35.7%至A. xylosoxidans的83.3%。肠杆菌目中，梯度扩散法CA为88.7%，出现8个VME和4个ME；DD仅64.2% CA，37/80株BMD敏感株被DD判为耐药（46.3% ME），仅1个VME。E. coli的DD CA为55.3%（17个ME，无VME），K. pneumoniae为57.1%（12个ME，无VME）。A. baumannii两种方法相对于2 mg/L界值的一致性均为86.8%。21/106株肠杆菌目（19.8%）的抑菌圈直径位于EUCAST技术不确定区域（ATU）；这些菌株BMD均敏感，按DD折点其中16株落入耐药类别（21–22 mm）而构成ME，5株（23 mm）判为敏感。排除ATU内菌株后，DD的CA升至74.1%，59株敏感株中21个ME，26株耐药株中1个VME；P. aeruginosa无菌株落入ATU。Bland–Altman分析显示梯度扩散法系统性低估MIC，平均差为?0.83 log₂稀释度（p < 0.001），几何平均比（GMR）为0.56；该偏倚见于肠杆菌目（?1.37 log₂稀释度；GMR 0.39；p < 0.001），以K. pneumoniae最明显（?1.57；GMR 0.34；p < 0.001）。A. baumannii无明显偏倚（+0.08 log₂稀释度；GMR 1.06；p = 0.63），非发酵菌总体亦无显著偏倚（?0.24；GMR 0.85；p = 0.11）。总体95%一致性限为?4.11至+2.46 log₂稀释度，各亚组差值标准差为1.28–1.68 log₂稀释度，未见差值大小与平均MIC之间的明显系统关系。原文总结认为，各方法与参考BMD的一致性均有限：除最小亚组外EA均低于90%，DD因ATU内菌株集中出现ME而CA明显低于梯度扩散法；A. baumannii两法相对于EUCAST界值一致性相当；梯度扩散法系统性低估肠杆菌目尤其K. pneumoniae的MIC，但对A. baumannii或其他非发酵菌未见此偏倚，总体一致性限较宽。

讨论部分总结：研究人员指出，准确FDC药敏对最后防线药物至关重要，但现有方法存在多种局限；商业检测产品准确性差异明显，DD的CA依琼脂和纸片制造商组合可报告为82.3%至95.5%。在本研究中，P. aeruginosa均敏感，A. baumannii在非发酵菌中MIC最高；肠杆菌目耐药主要局限于产NDM株（25/26株耐药株），这与NDM介导FDC耐药的结构基础及GAME CHANGER试验的临床信号一致。梯度扩散法与BMD的定量一致性低，DD与梯度扩散法呈相反错误谱：DD频繁产生ME，梯度扩散法系统性低估MIC并漏检耐药株。DD对肠杆菌目仅64.2% CA，几乎完全由ME驱动；80株BMD敏感株中37株被DD判为耐药，仅1株耐药株被漏检，结果与既往评估Thermo Fisher纸片的研究一致。BMD敏感肠杆菌目的抑菌圈中位直径为23 mm，轻微测量变异即可使菌株跨越分类边界；EUCAST引入ATU正针对此情形，本研究支持其效用：19.8%肠杆菌目落入ATU，均BMD敏感，其中16/21株（76.2%）被判为耐药，占全部ME的43.2%（16/37），支持EUCAST关于ATU内结果尽可能用第二种方法（如BMD）确认的建议。ATU外ME仍常见（35.6%；21/59）。本集合中DD对耐药检测敏感性高（96.2%；25/26）但特异性低（53.8%；43/80），提示DD或可作为排除耐药的筛查工具，但耐药及ATU结果需BMD确认。从临床角度看，DD的假耐药错误相对“安全”，但FDC常为最后线选择，高ME率仍可能导致患者接受安全性较差替代药物如多黏菌素或氨基糖苷类。CIRCE观察性试验初步显示，产MBL碳青霉烯耐药肠杆菌目感染患者接受FDC治疗时，不同DD分类间的临床治愈、临床反应及第14天和第28天生存相似；该发现尚属初步，尚未经同行评议或已发表BMD数据确认，结合本研究46.3%的BMD敏感肠杆菌目被DD判为耐药，原文提出DD可能系统性将BMD敏感株误判为耐药的疑问，并支持对肠杆菌目FDC耐药以BMD确认。P. aeruginosa（n = 26）中DD无分类错误。对A. baumannii、S. maltophilia和A. xylosoxidans，DD相对于2 mg/L界值的一致性分别为86.8%（33/38）、91.7%（11/12）和100%（18/18）；A. baumannii中DD漏检5/11株MIC > 2 mg/L者，但亚组菌株数少、耐药或高MIC菌株少，应谨慎解释。梯度扩散法对肠杆菌目CA高于DD（88.7% vs. 64.2%），但错误谱相反，26株耐药肠杆菌目中8株为VME；Bland–Altman分析提示系统性低估是原因。A. baumannii中梯度扩散法无系统偏倚（+0.08稀释度），EA为71.1%；相对于筛查界值的假阴性局限于参考MIC 4–8 mg/L者（DD 5/11，梯度扩散法3/11），MIC ≥ 16 mg/L者两法均检出。EUCAST未为A. baumannii、S. maltophilia或A. xylosoxidans提供临床折点，结果仅相对于MIC > 2 mg/L的筛查界值评估，不能定义临床敏感性，故不与临床折点结果直接可比。各亚组95%一致性限跨越5–6个倍比稀释度，提示即使考虑系统偏倚，单个菌株的一致性仍不能假定。所有11株偏差超过3个倍比稀释度的菌株均方向一致，梯度扩散法MIC为0.016–0.125 mg/L而参考MIC为0.25–2 mg/L；偏倚在决定分类的2–4 mg/L范围最大（?1.25 log₂稀释度），在参考MIC ≥ 8 mg/L时消失（+0.20 log₂稀释度），符合系统性低估低、中MIC而非随机测量误差。肠杆菌目中，梯度扩散法判为耐药的特异性为95.0%（4/80参考敏感株被判耐药），对耐药检测的敏感性为69.2%（8/26参考耐药株被判敏感）。两法错误谱互补：DD敏感加梯度扩散法耐药大多与BMD一致，而DD耐药加梯度扩散法敏感则不一致；两法均不能替代BMD，梯度扩散法分类亦不能可靠解决DD耐药问题（40株DD耐药且梯度扩散法敏感株中7株BMD耐药）；梯度扩散法漏检的耐药株其梯度扩散法MIC均为0.5–2 mg/L，即位于折点下两个倍比稀释度内，与系统低估一致；两法联合应用值得未来研究评估。局限性包括：单中心菌种库便利样本、产NDM肠杆菌目有意过度代表，报告敏感率仅反映集合构成而非人群流行率；部分基因型和菌种菌株数少（如仅5株产KPC肠杆菌目），若干菌种耐药株少，限制VME等亚组可靠估计；三法均采用最保守读数，可能放大方法间差异；仅评估一种DD和一种梯度扩散法产品，结果可能不适用于其他制造商同类产品。

研究结论翻译（5. Conclusions）：该单中心研究结果说明临床实验室FDC药敏试验的实际挑战。对肠杆菌目，DD和梯度扩散法均不能可靠重现BMD结果：所有较大亚组EA低于90%，且两法错误谱相反。DD很少漏检耐药，但将46.3%的BMD敏感分离株判为耐药；梯度扩散法特异性较高，但漏检8/26株耐药分离株，反映MIC系统性低估，在临床折点附近最明显。EUCAST ATU捕获了DD误分类的一部分但非全部。对非发酵菌一致性较高，但缺乏临床折点且高MIC分离株少，限制结论。上述观察适用于所评估的分离株、培养基和产品，需在其他集合和环境中验证；在本研究中，参考BMD确认仍属必要。