烟曲霉IPI1家族蛋白编码基因ipi1影响生长、产孢、应激反应及感染蜡螟幼虫死亡率

《Microorganisms》：The IPI1 Family Protein-Encoding Gene ipi1 in Aspergillus fumigatus Influences Growth, Sporulation, Stress Responses, and Mortality of Infected Galleria mellonella Larvae

　　

烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是一种威胁人类健康的机会性病原体，但其ipi1基因的功能尚不明确。研究人员通过同源重组构建了ipi1缺失株（Δipi1）、回补株（Δipi1::ipi1+）和过表达株（ipi1-OE）。对表型特征、应激反应、抗氧化酶活性、活性氧（ROS）水平、线粒体膜电位（MMP）和转录组谱进行了分析。在蜡螟（Galleria mellonella）感染模型中记录幼虫死亡率，并通过生存分析进行评估。与野生型（WT）相比，Δipi1和ipi1-OE均表现出生长减慢以及对氧化和渗透应激的反应改变。Δipi1表现出产孢密度增加和菌丝形态异常，并与更快的幼虫死亡相关。ipi1-OE表现出产孢密度短暂增加和分生孢子头减少，并与较低的幼虫死亡率相关。两种突变体均表现出总超氧化物歧化酶（T-SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性降低、ROS水平升高、MMP降低，以及参与跨膜转运和代谢的基因转录水平改变。结论：ipi1在烟曲霉的生长、应激反应、抗氧化防御、线粒体功能和产孢中发挥重要作用，其缺失或过表达与蜡螟感染模型中幼虫死亡率改变相关。

烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是一种机会性病原真菌，被世界卫生组织列为四种高优先级关键病原真菌之一；免疫受损人群、恶性肿瘤或中性粒细胞减少患者、异基因造血干细胞移植受者、实体器官移植受者以及长期接受糖皮质激素或免疫抑制治疗者均易感。该菌可感染皮肤、肺、眼、肾、骨、鼻窦、心脏和神经系统等多器官系统；慢性肺曲霉病每年约影响300万新患者，侵袭性曲霉病每年约25万例、发生率0.0041%，死亡率可高达50%。当前治疗主要依赖多烯类、棘白菌素类和唑类药物，但药物种类有限、靶点单一，且耐药与多重耐药菌株出现，使患者和临床医生的治疗选择有限、预后常较差。因此，研究更多烟曲霉基因功能可为新型抗真菌药物开发提供线索和潜在靶点。ipi1基因在真菌中广泛分布，但功能研究有限；已有研究报道嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）Rix1–Ipi3–Ipi1复合物和Las1–Grc3复合物可加工pre-rRNA的内转录间隔区2（ITS2）序列，促进rRNA成熟；酵母Ipi1可锚定Rix1复合物至pre-60S核糖核蛋白颗粒；光滑念珠菌（Candida glabrata）ipi1^R70H突变可导致生长迟缓、热耐受降低及对唑类和棘白菌素类的多重耐药。烟曲霉亦携带位于6号染色体的ipi1基因（AFUA_6G01990），但其功能尚未见报道。为此，研究人员构建Δipi1、Δipi1::ipi1+和ipi1-OE，系统分析其表型、应激反应、抗氧化酶活性、ROS、MMP、转录组及蜡螟感染模型中的幼虫死亡率，以明确ipi1在烟曲霉中的功能，并为抗烟曲霉感染策略和新型抗真菌药物研发提供参考。

关键技术方法：研究人员通过同源重组构建Δipi1、Δipi1::ipi1+和ipi1-OE，并用定量PCR（qPCR）验证拷贝数；开展菌落生长、产孢密度及倒置显微形态观察；按CLSI M38-A3微量稀释法检测唑类、多烯类和棘白菌素类敏感性；在含甲萘醌（menadione）、H₂O₂、NaCl和山梨醇的平板上测定生长抑制率；以DCFH-DA和Rhodamine 123结合流式细胞术检测ROS和MMP；测定T-SOD和CAT活性；进行RNA-seq及RT-qPCR；采用蜡螟（Galleria mellonella）感染模型和Kaplan–Meier/log-rank生存分析。菌株A1160、Af293及质控株Aspergillus flavus ATCC 204304来源于Fungal Genetics Stock Center；蜡螟幼虫来源于河南济源白云实业有限公司（河南，中国）。

研究结果：
3.1 ipi1生物信息学分析：基于12条IPI1/TEX10家族基因序列构建最大似然（ML）系统发育树，结果显示Fumigati组7个物种形成支持良好的单系分支，烟曲霉与A. fischeri聚类，A. lentulus与A. novofumigatus聚类，A. pseudoviridinutans与A. udagawae形成姐妹对并与A. viridinutans聚类；A. stella-maris与A. karnatakaensis以最高支持度聚类，A. brunneoviolaceus为其姐妹谱系，A. chevalieri近外群分支。该分析提示ipi1序列在曲霉属内具有特定系统发育关系。
3.2 ipi1对烟曲霉生长和产孢的影响：通过平板培养、菌落直径测量、产孢计数和倒置显微观察发现，Δipi1和ipi1-OE菌落直径显著小于WT；24 h时ipi1-OE产孢密度高于WT和Δipi1，48 h和72 h时Δipi1产孢密度最高；Δipi1菌丝粗细不规则、分枝减少、部分分生孢子头形态异常，ipi1-OE分生孢子头数量明显减少；回补株部分恢复生长和产孢密度改变。结论为ipi1与烟曲霉生长和产孢能力密切相关。
3.3 ipi1在烟曲霉对唑类、多烯类和棘白菌素类药物敏感性中的作用：采用肉汤微量稀释法检测发现，WT、Δipi1、Δipi1::ipi1+和ipi1-OE对伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、艾沙康唑、卡泊芬净和两性霉素B的敏感性均无显著差异，表明ipi1表达水平不影响烟曲霉对上述药物的敏感性。
3.4 氧化应激和渗透应激试验：通过含menadione、H₂O₂、NaCl和山梨醇平板测定生长抑制率发现，在20 μM menadione和1 M NaCl胁迫下，Δipi1和ipi1-OE生长抑制高于WT，Δipi1::ipi1+部分恢复Δipi1表型；在5 mM H₂O₂下，Δipi1与WT无显著差异，而Δipi1::ipi1+和ipi1-OE生长抑制低于WT；在0.3 M山梨醇下，Δipi1生长抑制降低，Δipi1::ipi1+未恢复该表型，ipi1-OE与WT无显著差异。结论为ipi1在介导烟曲霉对氧化和渗透应激的反应中起关键作用。
3.5 ROS水平测定：以DCFH-DA为探针、流式细胞术检测发现，WT和Δipi1::ipi1+相对荧光强度低于Δipi1和ipi1-OE，WT与Δipi1::ipi1+无显著差异，表明ipi1缺失或过表达导致真菌细胞内ROS积累。
3.6 MMP测定：以Rhodamine 123为探针、流式细胞术检测发现，WT相对荧光强度高于Δipi1和ipi1-OE，Δipi1::ipi1+部分恢复Δipi1的荧光强度，表明ipi1缺失或过表达降低烟曲霉细胞MMP并破坏线粒体膜电位稳态。
3.7 T-SOD和CAT活性测定：WT和Δipi1::ipi1+的T-SOD活性显著高于Δipi1和ipi1-OE；WT的CAT活性显著高于Δipi1和ipi1-OE，Δipi1::ipi1+与Δipi1无显著差异；提示该回补株中CAT差异可能与ipi1未恢复至原位点而由重组质粒提供有关。较高的抗氧化酶活性与较低ROS水平相一致。
3.8 差异表达基因（DEGs）对ipi1缺失的响应：RNA-seq分析发现WT与Δipi1间共52个DEGs，其中28个上调、24个下调；一个过氧化物酶体相关基因下调，其余DEGs主要富集于碳水化合物、脂质、氨基酸、维生素B6和碳代谢，CoA相关酶活性调控、转录调控、组蛋白修饰及物质跨膜转运等生物过程。原文认为这些转录变化可能构成Δipi1生长减慢、产孢密度增加和应激反应改变的基础。
3.9 ipi1对过氧化物酶体和跨膜转运蛋白相关基因表达的影响：RT-qPCR显示，与WT相比，Δipi1和ipi1-OE中过氧化物酶体相关基因AFUA_6G03910转录水平降低，跨膜转运相关基因AFUA_3G03820和AFUA_7G00440转录水平升高，AFUA_6G09710转录水平降低；Δipi1::ipi1+中这些基因部分或完全恢复至WT水平，与RNA-seq结果一致。ipi1在Δipi1中几乎检测不到，在ipi1-OE中显著升高，在Δipi1::ipi1+中与WT相当；actin作为内参基因的Ct值变异系数仅0.73%、标准差0.19个循环，满足BestKeeper和CV<5%标准，支持RT-qPCR归一化可靠。
3.10 ipi1对蜡螟感染模型中幼虫死亡率的影响：7 d内未处理组和PBS注射组幼虫存活率均为100%；WT孢子悬液注射组呈渐进性死亡；Δipi1组死亡更快，24 h死亡率达95%；Δipi1::ipi1+组与ipi1-OE组生存曲线完全重叠，二者7 d生存率均显著高于WT组。结论为ipi1缺失与更快幼虫死亡相关，而ipi1过表达与较低幼虫死亡率相关。

讨论部分总结：讨论指出，ipi1在真菌中广泛分布，既往功能研究主要集中于酵母科，烟曲霉中尚未报道；本研究发现ipi1缺失和过表达均损害生长并改变应激反应能力，缺失还增强体外产孢并增加蜡螟幼虫死亡率，过表达短暂增加体外产孢后回落至WT水平并降低幼虫死亡率。缺失与过表达表型部分重叠，原文提出可由多蛋白复合物亚基的剂量敏感性解释：Ipi1为Rix1-Ipi3-Ipi1复合物组分，参与pre-rRNA加工；Ipi1不足可能影响复合物组装，过量可能扰乱亚基平衡、螯合伙伴蛋白或形成无功能复合物，进而影响核糖体功能。生长抑制伴随T-SOD和CAT活性降低、ROS升高和MMP降低；ROS过量可造成DNA断裂、染色质浓缩、磷脂酰丝氨酸外化、内质网应激和钙释放、线粒体蛋白和脂质氧化损伤及MMP降低或崩溃，最终导致真菌凋亡或坏死。转录组显示碳水化合物、脂质、氨基酸、核苷酸和维生素代谢及跨膜转运相关基因改变；缺失ipi1增加转录正调控和剪接体相关基因转录，原文认为可能是对rRNA成熟缺陷所致翻译受损的补偿反应。跨膜转运基因变化可能解释对H₂O₂或山梨醇耐受增强，但对menadione和NaCl更敏感提示ipi1可能通过跨膜转运以外途径调控应激反应。毒力方面，Δipi1增加幼虫死亡率而ipi1-OE降低死亡率，但因未测定感染幼虫体内真菌负荷，现有数据仅建立ipi1与毒力相关表型的关联，尚不能定义其调控毒力的机制。与光滑念珠菌ipi1^R70H突变体不同，烟曲霉ipi1缺失或过表达未导致对唑类、棘白菌素类或多烯类耐药；该差异可能与ipi1突变形式不同及烟曲霉与C. glabrata间ipi1相似度低有关。研究局限在于WT由pyrG随机重插入A1160获得，Δipi1在ipi1位点携带pyrG，Δipi1::ipi1+和ipi1-OE重组质粒还含GFP和潮霉素B抗性基因（hph）盒，菌株并非完全等基因，不能完全排除pyrG插入位点或额外遗传元件对表型的影响；未来原位回补有助于解决该问题。

研究结论（译）：本研究中，研究人员证明ipi1在烟曲霉生长、抗氧化酶活性、细胞内ROS水平和MMP水平调控中起关键作用。此外，ipi1影响产孢和应激反应，并与蜡螟感染模型中幼虫死亡率改变相关，但具体机制仍需进一步研究。总体而言，本研究进一步拓展了ipi1的已知功能，并突出了不同物种间ipi1功能的相似性和差异性，为未来研究ipi1生物学功能提供了参考。