基于长读长全基因组测序与物种匹配比较基因组学的蛇肠道分离株功能潜力与安全风险分层：以 Enterococcus hirae SA0215、Lactococcus lactis SA0220 和 Enterococcus faecalis TP0208 为例

《Microorganisms》：Genome-Guided Analysis of Functional Potential and Safety Signals in Three Snake-Gut Bacterial Isolates

　　

蛇肠道细菌分离株可能具有独特的功能潜力，但其应用需要同时考虑菌株水平功能评价和安全风险筛查。该研究结合体外表型数据、长读长全基因组测序、物种匹配比较基因组学和多数据库筛查，对来自 Trimerodytes annularis 的前期高性能菌株 Enterococcus hirae SA0215 和 Lactococcus lactis SA0220 以及来自 Trimerodytes percarinatus 的 Enterococcus faecalis TP0208 进行了综合表征。三株菌在明胶酶和过氧化氢酶试验中均为阴性，且均不能有效利用黏蛋白作为碳源以支持旺盛生长；E. hirae SA0215 和 L. lactis SA0220 的胆汁盐水解酶（BSH）定性试验为阳性，L. lactis SA0220 还表现出显著的自聚集（auto-aggregation）和共聚集（co-aggregation）能力。基因组分析提示，E. hirae SA0215 具有与养分利用和细胞表面稳态相关的特征，并具有可能与抗菌活性相关的特征；而 L. lactis SA0220 在养分波动下表现出相对突出的酸应激相关模块和碳源利用策略。尽管 E. faecalis TP0208 具有多样的代谢相关模块，但其也携带与黏附、生物膜形成、胞外蛋白水解和抗菌药物耐药（AMR）相关的风险信号。基于表型和基因组证据的综合判断，E. hirae SA0215 和 L. lactis SA0220 可进一步开展体内安全性和有效性评价，而 E. faecalis TP0208 作为安全风险表征对象，需要进一步开展针对性安全评估。该研究为非传统宿主持有分离株的功能评价和风险分层提供了菌株水平框架。

研究背景方面，益生菌为摄入足够数量后对宿主产生健康益处的活微生物，其益生特性与安全风险需系统体外评价。传统益生菌资源主要来自乳制品、发酵食品及人和常见家畜胃肠道，近年来研究人员日益关注从非传统生态位发掘潜在益生菌。爬行动物具有较长进化历史和多样生态位，蛇类反复经历摄食—禁食周期，摄食后胃肠道质量、胃酸分泌、消化酶活性和营养转运迅速升高，消化完成后逐渐下降，肠道微生物群亦随之重构，提示蛇肠道可能存在营养获取、代谢转换和应激耐受方面具有独特适应特征的细菌资源。前期研究已从蛇肠道微生物群落与分离株筛选中获得具有胃肠道耐受和抗菌表型的候选菌株，并在测试表型范围内未发现明显安全风险，但非常规分离来源并不意味着所有分离株均具有益生潜力或满足安全要求，抗菌药物耐药和毒力相关遗传因子仍需菌株水平系统评价。尤其对肠球菌而言，尽管部分菌株有食品发酵或益生应用历史，E. faecalis 和 E. faecium 亦为重要机会性病原菌，基因组可塑性可促进耐药和毒力相关性状获得；欧洲食品安全局合格安全推定（QPS）框架下不能在属水平推定肠球菌安全，美国一般公认安全（GRAS）结论亦仅适用于特定物质或微生物来源成分在特定使用条件下的情形。因此，该研究在前期工作基础上补充体外功能与安全相关表型评价，并开展长读长全基因组测序和物种匹配比较基因组分析，以整合表型与基因组证据，刻画三株分离株的潜在功能特征并进行风险分层，为非传统宿主分离株的菌株水平功能评价和风险分层提供框架。

关键技术方法方面，三株分离株来源明确：E. hirae SA0215 和 L. lactis SA0220 分离自 Trimerodytes annularis 肠道，E. faecalis TP0208 分离自 Trimerodytes percarinatus 肠道。研究人员开展补充体外表型评价、长读长全基因组测序、物种匹配比较基因组学和多数据库筛查；采用纳米孔长读长测序平台获取数据，进行基因组组装、序列校正及组装质量评估；利用 GTDB-Tk 和 FastANI 进行物种鉴定与平均核苷酸一致性（ANI）分析；采用统一注释流程进行基因组结构与功能注释；基于 Panaroo 和 IQ-TREE 开展种内核心基因组系统发育与泛基因组分析；利用 antiSMASH、BAGEL4 和 dbCAN 预测生物合成基因簇（BGCs）、细菌素相关区域和碳水化合物活性酶（CAZymes）；利用 ABRicate 查询 CARD 和 VFDB 数据库，并筛查质粒复制子、前噬菌体和 CRISPR–Cas 系统。比较分析纳入 NCBI 来源的 44 株 E. hirae、31 株 L. lactis 和 50 株 E. faecalis 参考基因组。

研究结果如下。3.1 测序、基因组组装与三株分离株物种鉴定：通过长读长测序获得充足数据和高度连续基因组组装，GTDB-Tk 将三株分别鉴定为 E. hirae SA0215、L. lactis SA0220 和 E. faecalis TP0208；与同种参考基因组比较，三株最高 FastANI 值分别为 99.81%、98.86% 和 98.49%。3.2 基因组注释与功能分类：Bakta 分别注释到 2680、2304 和 3218 个编码序列（CDSs）；eggNOG-mapper 获得较高比例同源匹配，COG、KEGG 和 GO 注释显示三株基因主要分布于信息存储与加工及代谢两大类，碳水化合物转运与代谢、氨基酸转运与代谢均较突出，其中 E. faecalis TP0208 的碳水化合物代谢注释基因数最多。3.3 物种匹配的核心基因组系统发育与泛基因组特征：三株与同种参考基因组的 ANI 均超过 95%，支持种级归属；核心基因组树中三株均嵌套于相应物种分支而非形成独立来源特异性谱系，E. faecalis TP0208 位于与 E. faecalis LJX0909、EFSMS14 和 AT34 邻近的末端亚分支；三个独立同种数据集中分别检测到 77、203 和 420 个菌株特异性基因簇，泛基因组基因簇数分别为 5658、6614 和 6685，并报告核心、软核心、壳层和云基因簇组成及累积曲线。3.4 CAZymes、BGCs 与细菌素相关区域：dbCAN 分别获得 222、183 和 219 个 CAZyme 家族注释，糖苷水解酶（GHs）和糖基转移酶（GTs）为三株中注释数最多的两类；antiSMASH 预测 E. hirae SA0215 和 L. lactis SA0220 各含 6 个 BGCs，E. faecalis TP0208 含 2 个 BGCs；BAGEL4 预测 E. hirae SA0215 含 3 个候选细菌素或抗菌肽感兴趣区域，其中 2 个含注释为 Enterolysin A 的核心候选物，另 1 个为不完整 II 类羊毛硫肽相关区域；L. lactis SA0220 含 1 个注释为 Lactococcin B 的感兴趣区域，E. faecalis TP0208 未检测到明确候选细菌素或抗菌肽区域。3.5 预测的功能基因模块：E. hirae SA0215 含乳糖/半乳糖利用、胞外多糖（EPS）生物合成及精氨酸脱亚胺酶（ADI）系统多个组分；L. lactis SA0220 含由 gadB、gadC 和 gadR 组成的谷氨酸脱羧酶（GAD）/γ-氨基丁酸（GABA）相关模块、苹果酸-乳酸转化相关基因、糖原代谢相关 CAZyme 组合及与唾液酸摄取和初始分解相关的菌株特异性基因簇 nanT–nanA–nanK；E. faecalis TP0208 主要候选功能模块涉及麦芽糖/寡糖利用、柠檬酸代谢和蛋白水解；三株均携带 F₁F₀-ATPase 相关基因，bsh 仅见于 E. hirae SA0215 和 L. lactis SA0220；三株均未含经典生物胺合成基因 hdcA、tyrDC、tdcA、ldc 或 odc，但均携带 aguA 和 aguD。3.6 基因组安全风险筛查：PlasmidFinder 未检测到已知质粒复制子；Phigaro 在 E. hirae SA0215、L. lactis SA0220 和 E. faecalis TP0208 中分别预测 1、1 和 5 个前噬菌体区域，均归入 Siphoviridae 且未预测为可转座；E. faecalis TP0208 含 1 个完整 II-A 型 CRISPR–Cas 系统（cas9、cas1、cas2 和 csn2），附近还有 AbiEii 相关注释，E. hirae SA0215 和 L. lactis SA0220 未检测到完整 CRISPR–Cas 系统；CARD 筛查中 E. hirae SA0215 和 L. lactis SA0220 各检测到 1 个主要命中，分别为 AAC(6′)-Iid-like 和 lmrD，E. faecalis TP0208 检测到 6 个命中，代表性结果包括与内在头孢菌素耐受相关的 ireK、多药外排泵相关 efrA/efrB 及编码 ABC-F 核糖体保护蛋白的 lsaA；VFDB 筛查在 E. hirae SA0215 和 L. lactis SA0220 中未检测到达到阈值命中，E. faecalis TP0208 检测到 14 个命中，包括 ebpA–ebpC 和 srtC 菌毛位点、fsrA–fsrC 调控系统及下游 gelE–sprE 蛋白酶位点，并检测到聚集物质相关基因 asa1。3.7 补充体外功能与安全相关表型：在既定定性条件下，三株明胶酶和过氧化氢酶筛查均为阴性；基因组筛查显示 gelE 仅见于 E. faecalis TP0208，过氧化氢酶相关注释见于 E. hirae SA0215 的锰过氧化氢酶和 E. faecalis TP0208 的 katA，L. lactis SA0220 未检测到典型过氧化氢酶注释；BSH 定性筛查在 E. hirae SA0215 和 L. lactis SA0220 中为阳性、E. faecalis TP0208 中为阴性，与 bsh 仅见于前两株一致；黏蛋白实验中，48 h 时三株在 0.5% 猪胃黏蛋白补充下的 ΔOD₆₀₀ 均低于 0.5% 葡萄糖补充组（p<0.001），黏蛋白未产生与葡萄糖相当的促生长作用，E. coli ATCC 25922 参考株在 TSB 中加入黏蛋白后亦无额外促生长；三株在 1 h 后均出现一定程度自聚集，范围为 5.76% 至 13.46%，随后逐渐升高并于 24 h 达峰，L. lactis SA0220 的自聚集率（81.91% ± 2.13%）高于 E. hirae SA0215 和 E. faecalis TP0208（p<0.001）；三株与 E. coli ATCC 25922 的表观共聚集率亦于 24 h 达峰，L. lactis SA0220 的表观共聚集率（42.40% ± 1.79%）高于另两株（p<0.001）。

讨论部分总结：综合前期筛选、补充体外表型和物种匹配比较基因组分析，研究人员认为 E. hirae SA0215 和 L. lactis SA0220 适合开展针对性功能与安全验证，E. faecalis TP0208 应优先进行安全表征；这表明在初步表型筛选后增加菌株水平基因组评价，可推动候选菌研究从识别有利性状转向兼顾功能与风险的优先级设定。对 E. hirae SA0215，TDCA 沉淀表型与 bsh 存在的一致性提供了 bsh 介导胆汁盐转化的基因型—表型证据；乳糖/半乳糖利用与 EPS 相关模块可能共同支持胆汁盐胁迫下存活；ADI 系统、bsh 和 F₁F₀-ATPase 可能分别通过共轭胆汁盐转化、精氨酸代谢和胞内 pH 稳态维持提供多重胁迫背景支持；Enterolysin A 候选物可解释部分抗菌活性，但其已知靶标主要为革兰阳性菌，尚不足以单独解释对革兰阴性指示菌的抑制，且需进一步研究其体内对宿主肠道菌群平衡的影响。对 L. lactis SA0220，GAD 系统、苹果酸-乳酸转化和 F₁F₀-ATPase 可通过互补机制共同维持胞内 pH，较单一耐酸基因更好地解释其酸胁迫下高存活率；较高自聚集及与 E. coli ATCC 25922 的表观共聚集提示其具有明显的细胞表面互作特征；糖原相关 CAZymes 与唾液酸摄取和初始分解模块提示其可能通过内源糖原储备和外源唾液酸利用的协同策略适应营养波动；RiPP 相关区域为研究其抗菌表型遗传基础提供候选靶点，Lactococcin B 主要作用于与 L. lactis 近缘的物种，可能有助于资源有限时排除生态位高度重叠的竞争者。安全判断应整合单个命中的临床意义和可移动性、相关基因是否以成组模块出现以及相应耐药或毒力表型，而不能仅依据数据库命中数或模块是否成簇；E. hirae SA0215 和 L. lactis SA0220 未检测到达到阈值的 VFDB 条目，CARD 仅分别检测到 AAC(6′)-Iid-like 和 lmrD，且未观察到黏附、生物膜、胞外蛋白水解和多药耐药模块成组的风险模式；AAC(6′)-Iid-like 序列在 E. hirae 泛基因组中较常见，可能更多反映种属相关耐药背景，LmrD 通常需与 LmrC 形成功能性异二聚体转运系统；部分 L. lactis 虽保留 AGDI 相关基因，但因操纵子转录破坏可能不产生腐胺，故携带部分 AGDI 模块不等同于已表现有害产胺表型，可通过针对性功能实验评估。对 E. faecalis TP0208，其麦芽糖和麦芽寡糖相关转运与分解系统、柠檬酸转运—发酵途径、Opp/Dpp 型肽转运和胞内肽酶可拓宽可利用养分范围；EbpABC–SrtC 为 E. faecalis 中高度保守的菌毛系统，参与初始黏附和生物膜建立，Asa1 参与细胞聚集和与宿主细胞互作，FsrABC 调控的 GelE/SprE 胞外蛋白酶系统连接定植、胞外 DNA 释放、生物膜重塑和上皮屏障破坏；E. faecalis TP0208 可能存在营养保留、表面定植和受调控胞外作用相互关联的功能链；其检测到的药物反应相关基因与既往研究一致，多属于该物种广泛分布的内在药物反应背景，不能直接等同于获得性多药耐药，但结合上述风险信号，E. faecalis TP0208 更适合作为安全表征优先对象并需通过针对性体外和体内实验逐项评估。该研究亦受菌株数量和实验条件限制，未来可扩大蛇源分离株采样并纳入其他来源同种菌株，在标准化实验条件下区分菌株差异与生态来源影响；对 E. hirae SA0215 可优先鉴定候选抗菌产物及其活性谱，对 L. lactis SA0220 可通过测定糖原含量和游离唾液酸利用验证碳源利用假设，在进一步安全证据支持下开展体内宿主耐受性、肠道持续性和实际功能效果研究；对 E. faecalis TP0208 应优先分析相关高风险位点的完整性和表达状态，并在现有药敏结果和表型筛查基础上进一步量化耐药表型、考察生物胺产生及与宿主细胞相容性。

研究结论（翻译）：该研究整合体外表型评价、长读长全基因组测序和物种匹配比较基因组学分析，评估三株蛇肠道分离株的菌株水平功能潜力与安全信号。体外评价和全基因组分析共同表明，Enterococcus hirae SA0215、Lactococcus lactis SA0220 和 Enterococcus faecalis TP0208 具有不同的候选功能特征和安全风险谱。参与胆汁盐代谢和细胞内稳态调节的系统，以及候选抗菌系统，可能有助于 E. hirae SA0215 应对胆汁盐和酸碱波动，注释为 Enterolysin A 的候选物为后续抗菌机制实验提供靶点。L. lactis SA0220 表现出相对较好的耐酸和聚集特性；全基因组分析提示其携带 GAD 相关酸应激模块，并具有与糖原储备和唾液酸利用相关的候选碳源利用策略。E. faecalis TP0208 具有相对灵活的养分利用潜力，但也携带与生物膜形成、胞外蛋白水解和抗菌药物耐药相关的成组安全信号，因而更适合作为风险表征的优先对象。该研究提示，蛇肠道这一非传统生态位可能蕴含独特的菌株资源，并为理解其环境适应和功能分化提供基因组线索；然而，其作为候选菌的价值仍取决于菌株功能表型、机制线索和安全风险的综合评估。