《Microorganisms》：From Waste to Wealth: Integrating Biological Systems and Molecular Intelligence for Lignin Valorization
木质素是一种丰富且可再生的芳香族聚合物，但其结构异质性阻碍其高效生物转化。与以往聚焦单一酶、途径工程或特定生物产品的综述不同，本文全面综述了木质素结构特征、微生物降解机制及生物转化方面的最新进展。重点讨论关键木质素降解酶，包括漆酶（laccase）、木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）的催化机制，以及真菌、细菌和合成微生物联合体（synthetic microbial consortia）在木质素生物转化中的应用。还涵盖通过连续催化反应将异质性木质素衍生芳香族化合物导入中心碳代谢（central carbon metabolism）的代谢途径。此外，研究人员评估了人工智能（AI）和机器学习（ML）在酶设计与生物过程控制中的新兴应用。最后，整合技术经济（techno-economic）和生命周期（life-cycle）考量以指导规模化部署。本综述为从实验室生物催化到工业生物炼制（industrial biorefineries）的跨尺度转化提供了深入见解。
1. Introduction
木质素是陆地生物质中丰富的可再生芳香族聚合物，也是燃料、化学品和功能材料的重要潜在原料。然而，其由不同单木质醇（monolignols）经随机自由基偶联形成的三维芳香结构具有高度异质性，H/G/S组成、单元间连接和缩合C-C键随植物种类和生物质类型变化，导致其较碳水化合物聚合物更难解聚和选择性转化。化学和热化学方法可实现较快解聚，但常受能耗、苛刻条件、催化剂或设备要求及副产物限制；生物方法则利用木质素降解酶、微生物和微生物联合体，在较温和条件下实现较高生化选择性。现有生物转化可生成香草醛（vanillin）、顺,顺-黏康酸（cis,cis-MA）、聚羟基脂肪酸酯（PHAs）、脂质和功能生物材料等，但仍受底物异质性、转化动力学较慢、底物利用不完整、产物抑制和产物分布控制有限等制约。酶工程、代谢工程、合成细胞工厂和微生物联合体可提供互补策略，但传统试错工程受序列和代谢设计空间大、酶活性与稳定性等权衡限制。人工智能（AI）和机器学习（ML）中的生成蛋白模型、适应度景观映射和分子动力学模拟为加速酶设计及代谢与过程优化提供新机会。本文提出连接分子智能、工程化生物系统和工业生物产品的收敛工程视角，并纳入过程尺度约束，以弥合木质素生物转化从实验室到生物炼制应用的转化差距。
2. Overview of Lignin
2.1. Origins and Structural Architecture
木质素由苯丙烷单体经酶促脱氢聚合形成，因生物合成高度随机而缺乏均匀键合模式。其框架主要由对羟基苯基（H）、愈创木基（G）和紫丁香基（S）单元组成，分别源自对香豆醇、松柏醇和芥子醇，并通过多种化学键形成致密、抗降解的三维芳香网络。按植物来源可分为软木、硬木和草本木质素；软木木质素含量通常最高，硬木次之。软木以G单元为主，硬木含G和S单元，草本含G、S和H单元且H单元较高。硬木因S/G比较高和β-O-4醚键丰富而更易解聚；软木因G单元占优和缩合C-C键较多而更抗酶解和微生物降解。
2.2. Chemical Linkage Diversity and Molecular Functionalities
单元间连接基序决定解聚效率、产物分布和总产率，主要包括醚键C-O和C-C键。β-O-4是最丰富的连接，约占单元间连接的一半，是化学和生物降解的主要断键目标；其他连接包括4-O-5、β-5、β-β′、β-1′和5-5′等。木质素大分子富含-OCH
3、-COOH、-PhOH和-OH等反应性基团，其相对丰度随木质素类型变化。虽然这些官能团赋予高化学可修饰性，但也增加分离和高值化复杂度；在苛刻酸碱提取条件下，高反应性-PhOH易发生自由基诱导偶联和缩合，形成新的抗降解C-C键，降低下游解聚效率。
3. The Biodegradation Enzyme Systems of Lignin and Heterologous Expression
3.1. Lignin-Degrading Enzymes
木质素生物降解主要由真菌和细菌分泌的漆酶（laccase）、木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）驱动，并辅以芳醇氧化酶、葡萄糖脱氢酶、吡喃糖2-氧化酶和纤维二糖脱氢酶等辅助氧化酶。漆酶是多铜多酚氧化酶，通过连续单电子氧化催化酚类底物；非酚结构氧化通常需小分子氧化还原介体。其I型铜位点提取电子并传递至II型和III型铜组成的三核铜簇，最终将O
2还原为H
2O并产生芳基自由基；自由基不一定导致净解聚，也可能发生偶联。MnP是含血红素过氧化物酶，以H
2O
2和Mn
2+为天然氧化还原介体，经Compound I和Compound II生成可扩散Mn
3+-有机酸复合物，优先攻击酚型木质素；过量H
2O
2可使其不可逆转化为惰性Compound III。LiP可裂解非酚芳香环结构，经LiP I和LiP II完成电子转移，氧化电位较高，能促进C-C键断裂、芳环开环和特定亚甲基羟基化；其活性强烈依赖酸性pH，且高催化活性与长期稳定性未必一致。此外，多功能过氧化物酶（VP）、染料脱色过氧化物酶（DyP）及辅助氧化还原酶参与完整解聚和矿化。天然酶在野生型宿主中表达量低、发酵周期长，异源表达是提升产量的重要途径。
3.2. Heterologous Expression of Degradative Enzyme Systems
异源表达系统包括原核、酵母和丝状真菌平台。大肠杆菌（E. coli）遗传背景清楚、操作简便、生长快，已用于表达芽孢杆菌属（Bacillus）和某些真菌来源漆酶，但常受蛋白折叠不当和包涵体限制，可通过分子伴侣和信号肽替换等策略改善。酵母系统可进行翻译后修饰，利于正确折叠、二硫键形成和糖基化，常用毕赤酵母（P. pastoris）和酿酒酵母（S. cerevisiae）；但异常或过度糖基化可能阻碍底物进入活性中心，整体活性有时低于优化后的原核系统。丝状真菌如黑曲霉（A. niger）、里氏木霉（T. reesei）和构巢曲霉（A. nidulans）具有较强胞外蛋白分泌能力，可简化下游纯化，是工业生产的潜在平台。
4. Lignin-Degrading Microorganisms
4.1. Fungal Microorganisms
真菌是研究最广泛的木质素降解微生物，白腐真菌可矿化木质素，分泌非特异性氧化酶攻击芳香环骨架和侧链；不同白腐菌的木质素降解酶谱不同，有的依赖漆酶，有的分泌LiP、MnP和VP协同作用。白腐真菌虽可将木质素完全分解为CO
2和H
2O，但不能以木质素为唯一碳源和能源。软腐真菌和褐腐真菌也参与天然木质素转化；软腐真菌总体降解能力常低于白腐真菌，但部分工业菌株在优化固态发酵下对难降解硫酸盐木质素表现较高转化效率。褐腐真菌约占木腐担子菌的7%，主要定殖软木，采用非酶-酶两阶段策略，先经Fenton化学解聚结晶纤维素和半纤维素，仅部分氧化和断裂木质素骨架，留下改性富木质素残渣并形成特征性立方开裂。多数应用菌株仍为野生型，长发酵周期和复杂真核基因组难以精确遗传操作限制其工业应用。
4.2. Prokaryotic Microorganisms
相较真菌，细菌生长快、环境适应性强、遗传操作便利。部分原核微生物分泌多铜氧化酶或过氧化物酶，将木质素及衍生物转化为低分子量芳香化合物或中心代谢中间体。芽孢杆菌属（Bacillus）和链霉菌属（Streptomyces）较突出；例如某些芽孢杆菌在碱性条件下可降解木质素，链霉菌可分泌MnP和漆酶并具有完整木质素代谢途径。总体而言，原核微生物是木质素高值化的重要替代和补充平台。
4.3. Microbial Consortium
木质素降解通常依赖多酶系统和多代谢途径协同。单菌株代谢能力有限，常难实现全面高效降解；微生物联合体通过功能互补和代谢交叉喂养提高解聚效率和产物多样性。一个成员可将聚合木质素转化为香草酸、丁香酸或原儿茶酸等芳香中间体，供下游芳香族分解微生物利用；交叉喂养还可涉及生长支持代谢物、辅因子或信号分子交换。联合体性能不仅取决于单菌催化能力，也取决于代谢互作方向和强度。但种间竞争可能争夺碳源、氮源、氧、微量元素或芳香中间体，快速生长种群可能排挤慢生长功能菌，副产物也可能抑制其他成员。因此需通过接种比例、分期接种、选择性营养供给、时空分离及pH、温度、溶氧和底物浓度调控维持功能稳定。低温适应联合体可在低温下高效降解秸秆，嗜热联合体则适合高温快速反应场景；工业应用还需控制污染并建立受控接种和原料预处理体系。
5. Mechanisms and Metabolic Pathways of Microbial Lignin Degradation
5.1. Degradation Mechanisms
微生物木质素降解总体路径已较清楚。微生物分泌胞外氧化还原酶系统，但天然木质素高度交联和空间异质，使大分子酶受空间位阻限制，难以直接穿透致密细胞壁。降解初期，黄酮类、单宁和木脂素等低分子量芳香化合物可被激活为可扩散介体，在酶系统与木质素大分子间进行长距离电子传递，引发关键化学键氧化断裂并产生高反应性苯氧自由基；随后非特异性自由基攻击将木质素解聚为低分子量单体混合物，主要为对香豆醇、松柏醇和芥子醇。工业预处理常耗竭天然介体，因此实际生物过程可能需要外源补充。
5.2. Microbial Metabolism and Biological Funnel Effect
解聚木质素结构复杂，生物漏斗策略可将异质性芳香化合物导入微生物中心代谢。该过程包括O-脱甲基化、羟基化和脱羧化等连续生化反应。
5.2.1. O-Demethylation
O-脱甲基化是木质素衍生芳香化合物微生物降解的关键反应。G和S单元富含-OCH
3，使芳环化学稳定性高，阻碍下游开环；将惰性-OCH
3转化为活性-OH是解锁抗降解芳香结构并进入中心邻苯二酚中间体的关键步骤。主要酶系统包括Rieske非血红素铁加氧酶（ROs）、细胞色素P450单加氧酶（P450s）和四氢叶酸（THF）依赖型脱甲基酶。ROs和P450s依赖NAD(P)H电子传递激活分子氧，经瞬态半缩醛中间体生成脱甲基产物和甲醛；THF依赖型脱甲基酶则通过非氧化机制将甲基直接转移至THF。ROs和P450s产生的甲醛具有细胞毒性和酶抑制效应，减轻甲醛积累是提高催化效率的重要策略。VanAB是ROs的经典例子，VanA为加氧酶，VanB为含FAD和[2Fe-2S]簇的还原酶；GcoAB等P450系统经理性设计和定点突变可扩展底物谱。LigM和DesA分别介导香草酸/3-O-甲基没食子酸和丁香酸的THF依赖型脱甲基化，生成5-甲基-THF并进入氨基酸合成；但高流通量会增加THF消耗，异源宿主需重编程叶酸合成网络。
5.2.2. Hydroxylation
羟基化是O-脱甲基化之后为芳环开环做准备的关键过程。许多木质素衍生单体仅含单个羟基或非相邻取代基，苯环共振能高，直接亲电开环困难；羟基化通过在特定位置引入新羟基构建邻二酚或对二酚结构。该过程主要由高特异性单加氧酶和羟基化酶介导，是生物漏斗将多种前体导入原儿茶酸（PCA）或邻苯二酚（CAT）的必需途径，可分为黄素依赖型单加氧酶和双组分黄素依赖型芳香羟基化酶。PobA是黄素依赖型单加氧酶的经典代表，以FAD为辅因子，消耗NAD(P)H和O
2，在4-羟基苯甲酸C3位区域选择性插入羟基生成PCA，是H单元木质素衍生芳香化合物进入中心代谢的枢纽。PheA1A2是双组分黄素依赖型芳香羟基化酶的代表，由独立黄素还原酶和加氧酶组成，可将苯酚区域选择性羟基化为CAT。
5.2.3. Decarboxylation
芳香脱羧化与O-脱甲基化和羟基化并行，为后续开环准备环结构。按羧基被氢负离子或羟基取代，可分为还原型和氧化型脱羧化。木质素降解细菌中表征的还原型脱羧酶主要属于酰胺水解酶超家族（AHS）或UbiD型家族。AHS酶以(β/α)
8桶状折叠中的单核或双核金属中心为结构特征，LigW可催化5-羧基香草酸转化为香草酸并释放CO
2。UbiD型脱羧酶消耗二甲烯丙基焦磷酸将FMN转化为异戊烯化黄素单核苷酸（prFMN），经瞬态环加成中间体裂解芳香C-C键，使脱羧不可逆；AroY可催化原儿茶酸转化为邻苯二酚。氧化型脱羧酶主要分布于白腐真菌，常由ROs和含黄素单加氧酶（FMOs）催化。这些脱羧酶系统为代谢工程和合成生物学绕过木质素生物转化瓶颈提供工程基础。
6. Bioconversion of Lignin into High-Value Products
木质素可作为可持续碳源和高值芳香化合物合成原料，经生物催化转化为香草醛、对羟基苯甲酸、原儿茶酸、焦性没食子酸等单体，以及苯、甲苯和二甲苯等平台化学品；好氧微生物发酵还可转化为大宗芳香聚合物。木质素因丰富芳香骨架和反应性官能团可作为热塑性聚合物可再生原料，具备替代石油基塑料的潜力。合成生物学和代谢工程推动木质素生物转化从降解副产物粗利用进入靶向生物制造阶段。
6.1. PHA
聚羟基脂肪酸酯（PHA）是微生物由羟基烷酸单体经酯键聚合的线性聚酯，具有良好生物相容性、生物可降解性和可再生性，在生物医学植入物和环保包装中具应用价值。代谢工程使微生物先分解木质素生成中间代谢物，再用于PHA生物合成。恶臭假单胞菌（P. putida）因高效降解木质素和合成PHA能力成为关键底盘；P. putida KT2440可将对香豆酸和阿魏酸等经β-酮己二酸途径转化为CoA中间体用于PHA合成。理性途径设计和基因工程可提高PHA产量和木质素利用效率；例如工程化P. putida A514在AFEX预处理木质素残渣发酵中PHA含量达细胞干重的73.5%，较野生型提高37%。跨物种基因表达也显示潜力，如R. palustris异源表达Cupriavidus necator H16 phaP1基因后可直接由木质素衍生底物合成PHA。上述研究表明，整合芳香族分解代谢、前体供给和PHA聚合途径可将木质素衍生芳香物有效导向PHA生物合成。
6.2. Lipids
微生物可将木质素或其衍生物转化为脂质，作为食品添加剂和生物燃料原料。红球菌属（Rhodococcus）因芳香化合物代谢能力强而具突出潜力；R. jostii RHA1和R. opacus PD630可通过β-酮己二酸途径和苯乙酸途径协同作用降解木质素及衍生物，将碳导向中心代谢以提供脂质合成前体。结合预处理技术，共培养系统可促进木质素解聚和脂质生产。R. opacus NRRL B-3311以氨纤维膨胀玉米秸秆木质素为底物，在20%木质素消耗率下72 h内脂质积累达32 mg/L；R. opacus PD630经预处理、热脱毒和漆酶辅助处理并在2 L生物反应器放大后脂质产率可达1.83 g/L，预处理较单工艺提高脂质浓度达75.6%。红球菌属可利用结构多样芳香底物，预处理、脱毒和补料分批发酵可改善底物可及性和脂质积累。
6.3. Vanillin
香草醛是木质素解聚的重要芳香产物，广泛用于食品、化妆品和医药工业。天然香草醛仅从香草荚提取，成本高；生物技术生产成为可持续替代。微生物可由葡萄糖、酚类二苯乙烯、异丁香酚、丁香酚或阿魏酸经非氧化脱羧和CoA依赖非β-氧化等途径合成香草醛。尽管已有微生物木质素生物转化制香草醛报道，但滴度常处痕量水平。代谢工程显著提升产量，例如B. ligniniphilus L1发酵预处理木质素并敲除香草醛脱氢酶基因（vdh）后，香草醛滴度由12.6 mg/L提高至352 mg/L，约提高28倍；Arthrobacter sp. C2通过敲除苯甲醛脱氢酶基因（xylC）并过表达香草醇氧化酶基因（pchF），以碱木质素为底物时香草醛产率达0.85 mg/(g·h)。但异质性木质素制香草醛仍受适宜芳香前体低且可变、中间体转化不完整限制，需协调优化底物预处理、前体转化、产物形成和回收。
6.4. Cis,Cis-MA
顺,顺-黏康酸（cis,cis-MA）是二羧酸合成的重要中间体，可进一步加工为尼龙和聚酯等大宗化学品。目前工业上主要依赖石油基化学合成；以可再生生物质生物生产cis,cis-MA更环保。cis,cis-MA是β-酮己二酸途径中间体，多种芳香化合物利用细菌可通过邻苯二酚1,2-双加氧酶将邻苯二酚转化为cis,cis-MA。P. putida既是PHA生产者，也是cis,cis-MA生物合成平台。基因过表达、全局分解代谢调控基因敲除、恒速补料和高pH补料等集成优化策略可提高重组P. putida KT2440的cis,cis-MA滴度、产率和生产率；以木质素流为底物的复杂体系中工程菌可达3.7 g/L。未来需同时优化原料预处理、代谢通量分布、产物耐受性和过程生产率。
6.5. Biomedical Materials
木质素经初步解聚后具有更多活性羟基和改善的亲水性，可通过化学修饰转化为高性能生物医学材料。例如，将木质素-硫化铜（LS-CuS）纳米复合材料引入聚乙烯醇（PVA）水凝胶，构建近红外（NIR）响应型LS-CuS@PVA复合水凝胶，具有光热、光动力和类过氧化物酶活性；在H
2O
2存在下，NIR照射10 min可降低大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落数，并清除成熟生物膜、抑制新生物膜形成，为先进伤口敷料提供新策略。木质素-壳聚糖-PVA复合水凝胶利用木质素结构特征，通过氢键和离子相互作用交联，增强力学强度、蛋白吸附能力和伤口微环境调控能力，并在小鼠模型中促进伤口愈合。熔融丝材制造制备的木质素-聚乳酸复合材料可用于3D打印，具有抗氧化活性，并可通过结构设计实现可调药物释放，适用于个性化伤口敷料。总体而言，木质素不仅可作为碳源，也可作为生物医学材料的功能结构组分。
7. Emerging Role of AI in Lignin Valorization
尽管取得进展，木质素结构异质性和抗降解性仍是高效转化的核心瓶颈。AI和ML的深度整合推动木质素高值化从传统试错向数据驱动精准工程转变，主要体现于分子层面酶设计和系统层面代谢与生物过程优化。AI的实际价值不仅取决于模型架构，也取决于数据集质量与代表性、模型验证严谨性及计算预测的实验验证程度。
7.1. AI-Driven Molecular-Level Enzyme Design
降解酶的效率和稳定性是木质素生物转化的关键因素。例如，漆酶的工业应用常受高氧化还原电位与结构稳定性之间权衡限制。ML可辅助识别与目标表型相关的序列特征和突变组合，缩小实验搜索空间；利用ML进行漆酶特征提取可识别调节热稳定性的上位性位点，在不损失催化性能的情况下延长半衰期。然而，此类模型预测性能高度依赖训练数据质量、规模和多样性；酶活性和稳定性数据常来自不同底物、测定形式、pH、温度、酶制剂和活性定义，异质性可引入系统噪声和偏倚，限制模型迁移性。蛋白语言模型和逆折叠等生成式和结构基AI模型为序列生成和结构优化提供机会，但计算合理性不等同于实验证明的催化功能；生成序列可能具有良好预测折叠或稳定性，却表达差、辅因子掺入不正确、底物特异性改变或催化活性不足。因此，AI指导的酶设计应被视为候选生成和优先级排序策略，而非生化筛选替代。实验验证的AI/ML应用已显示定量收益，如贝叶斯优化与AquaSolv Omni生物炼制结合，基于实验测定的木质素产率和结构特征迭代选择水热预处理条件，实现木质素回收率和β-O-4连接含量的同时优化；XGBoost模型预测碱催化水热解聚生物油和固体残渣产率的R
2分别为0.836和0.764，但生物油产率与独立实验存在明显偏差，说明实验验证和模型迁移性评估的重要性；将ML与虚拟样本生成和反向设计结合优化多金属氧酸盐催化木质素氧化解聚时，人工神经网络对木质素转化率、酚产率和苯乙酮产率的R
2分别为0.91、0.90和0.90，引入虚拟样本和先验知识后平均模型R
2由0.66提高至0.98。总体而言，AI/ML可通过减少实验搜索空间、识别关键过程变量和指导木质素回收、结构特征及解聚性能优化促进木质素转化；但预测与实验观测间的差异表明，AI辅助木质素转化应被视为迭代实验-计算工作流，而非实验优化替代。
7.2. AI-Driven Systemic Optimization
AI的潜力不仅限于单个酶设计，还扩展到代谢和生物过程系统优化。AI和ML可整合基因组、转录组、蛋白质组和代谢组信息与基因组尺度代谢模型，识别潜在代谢瓶颈并预测将碳通量导向目标产物的策略。然而，基于基因组尺度模型或强化学习框架的预测对生物网络和实验约束的完整性与准确性敏感；代谢模型可能无法充分捕捉调控互作、酶饱和、热力学约束或情境依赖细胞响应。因此，计算预测的途径干预应被视为可检验假设，而非实验确立的最优策略。基于贝叶斯优化等AI过程优化可建立过程变量、木质素结构特征和产物分布间关系，减少实验次数；但若实验设计仅探索狭窄操作窗口或未明确纳入重复变异，表观优化效率可能产生误导。对木质素转化而言，原料组成、木质素分离方法、溶剂系统、粒径、预处理历史和分析方法差异可显著影响模型迁移性，因此过程模型应使用独立测试集或在与训练条件不同的前瞻性实验中评估。AI模型可靠性根本上受训练数据质量约束；木质素相关数据集因结构异质性和实验测量强方法依赖性而尤为困难，不同实验方案产生的数据不应未经归一化或适当统计处理即 indiscriminately 合并。此外，随机划分测试集上的高性能不一定表明模型可推广至新酶家族、底物、原料或操作条件；每个模型均有适用域，超出适用域的预测应谨慎解释。可重复AI辅助研究还需报告完整数据集及数据处理、模型架构、参数设置和验证程序等信息，并报告失败预测和负实验结果，以避免选择性报告导致过于乐观的评估。
8. Conclusions
木质素是最丰富的可再生芳香族聚合物之一，对未来生物炼制既是重大挑战也是重要机遇。其内在结构异质性、可变H/G/S组成和多样单元间连接仍是通用高效生物转化的主要障碍。木质素降解酶、工程化微生物系统、微生物联合体、代谢漏斗以及AI辅助分子和过程工程等进展提供了互补策略。然而，多数报道技术仍处于实验室或早期中试阶段，其在异质性工业木质素原料中的性能尚待系统表征。所提出的整合生物系统、分子智能和工业生物产品的收敛工程框架，为连接分子设计与过程尺度木质素高值化提供概念策略；但不应仅凭酶性能、产物滴度或实验室规模转化效率即认为其商业可行。向工业实施严谨过渡，需从实验室阶段起将定量技术经济分析（TEA）和生命周期评价（LCA）纳入框架。技术经济上，未来研究应更一致地将实验和过程数据纳入TEA模型；过程假设、系统边界和数据质量差异会限制不同木质素高值化途径经济评估的可比性，因此需更一致的建模方法识别经济性能关键因素并优先支持更具工业实施潜力的策略。环境可持续性应通过LCA评价，而非仅由木质素可再生性推断；相关指标应包括温室气体排放、累积能源需求、水耗、溶剂使用、废物产生，以及适用时的土地利用和资源耗竭影响。评估应定义涵盖木质素原料收集与预处理、酶或微生物转化、曝气与能量输入、产物回收与纯化及废物处理的全过程边界，并以一致功能单位和系统边界与常规石油化工路线比较，判断木质素衍生品能否实现有意义的环境负担降低。因此，未来发展应将分子工程和生物系统优化与过程尺度技术经济和生命周期评价整合；在此框架内，酶稳定性、微生物生产率、产物产率或过程效率的改进不仅应依据生物学性能评价，还应评价其对生产成本、能源需求、温室气体排放和总体环境负担的影响。此类整合评估策略将为判断特定木质素高值化途径能否从实验室验证推进至经济竞争且环境有益的工业过程提供更严谨依据。
