塔霍河与萨多河口粪便指示菌与肠道沙门菌的空间异质性及抗菌药物敏感性表型分析：一项短期监测研究

《Microorganisms》：Spatial Heterogeneity of Fecal Indicator Bacteria and Salmonella enterica in the Tagus and Sado Estuaries: A Short-Term Monitoring Study with Antimicrobial Susceptibility Profiling

　　

河口接收来自多种来源的微生物输入，但短期监测可能掩盖明显的局部异质性。研究人员评估了葡萄牙塔霍河（Tagus）与萨多河（Sado）河口的粪便指示菌（FIB, fecal indicator bacteria）、肠道沙门菌（Salmonella enterica）发生情况以及抗菌药物敏感性。于2025年5月1日至6月25日期间在六个位点开展六次采样活动，共采集36份表层水样，并采用基于ISO的培养方法进行分析。FIB浓度在各位点间差异显著：大肠埃希菌（Escherichia coli）Friedman χ² = 23.905，p < 0.001，Kendall’s W = 0.797；总大肠菌群（total coliforms）χ² = 21.333，p < 0.001，W = 0.711；肠道肠球菌（intestinal enterococci）χ² = 24.234，p < 0.001，W = 0.808；而配对河口水平各次采样活动均值无显著差异。FIB之间强相关，主成分分析（PCA）识别出一个占主导的污染梯度（PC1 = 86.7%）。在五个位点从10/36份样本（27.8%）中回收肠道沙门菌；探索性Holm校正分析中，阳性样本FIB浓度更高。8株沙门菌分离株在受试药物组合内未记录到抗菌药物耐药，而2株显示多重耐药表型。上述发现支持空间分辨监测，但较短采样窗口无法进行季节性推断或年度推断。

河口是淡水、海水、沉积物与人类活动在短空间尺度内相互作用的动态过渡带，同时承受城市污水、雨水径流、农业径流、工业与港口活动以及人源和动物源粪便输入。基于培养的粪便指示菌（FIB；用于指示卫生学污染与潜在暴露风险的指标菌）仍是水质监测的核心工具，但其为病原体替代指标而非直接病原学测量。塔霍河与萨多河是葡萄牙两个主要过渡水体系统，二者在城市密度、土地利用、工业活动、水动力及点源和面源污染分布上存在差异；葡萄牙流域规划亦识别出两水文区域存在显著压力与管理挑战。因此，全河口比较可能掩盖局部热点和位点特异性污染模式。肠道沙门菌（Salmonella enterica；可经污水、农业径流和野生动物输入进入河口并持续存在的水源性/食源性病原菌）受到关注，且水生环境可接收来自生活、医疗、农业和工业途径的抗菌药物耐药菌及耐药决定因子。基于此，研究人员开展短期、比较性监测研究，而非年度季节性评估，目标包括量化每个河口三个位点的大肠埃希菌（Escherichia coli）、总大肠菌群（total coliforms）和肠道肠球菌（intestinal enterococci）；比较研究期间位点间及塔霍河与萨多河系统间的空间模式；表征S. enterica发生与血清型分布；探索FIB浓度与沙门菌检出的关系；表征回收分离株的抗菌药物敏感性表型。研究得出，位点水平存在显著FIB空间异质性，而配对河口水平均值无显著差异；指示菌强相关并形成主导污染梯度；S. enterica在多数采样位点被检出，阳性样本FIB较高但仅属探索性共现；多数分离株受试组合内无耐药记录，少数显示多重耐药（MDR；对至少三类抗菌药物类别中至少一种药物获得性非敏感）表型。其意义在于支持空间分辨的微生物监测，并为更全面监测提供透明基线，同时明确短期窗口不能支持季节性、年度或耐药流行率推断。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究于2025年5月1日至6月25日在葡萄牙塔霍河与萨多河口六个目的性选择位点开展六次采样活动，共36份表层水样；塔霍河位点为Alhandra、Parque das Na??es、Póvoa de Santa Iria，萨多河位点为Mitrena、Portal dos Musgos、Alcácer do Sal。采用ISO 9308-1:2014及Amendment 1:2016计数总大肠菌群和大肠埃希菌，ISO 7899-2:2000计数肠道肠球菌；按ISO 19250:2010检测沙门菌，VITEK^? 2 Compact生化确认，并在Portuguese National Institute of Health Doutor Ricardo Jorge技术科学支持下按White–Kauffmann–Le Minor方案血清分型；纸片扩散法检测19种抗菌药物，按EUCAST version 15.0判读。统计采用Friedman检验、Kendall’s W、配对Wilcoxon符号秩检验、Spearman秩相关、Kendall’s τ、PCA及探索性Mann–Whitney U检验加Holm校正，并用Python 3.11的SciPy与scikit-learn复算。

研究结果如下。3.1 数据集完整性与位点特异性浓度：基于36份计划样本的完整FIB矩阵进行描述统计，未因FIB数据缺失排除样本；Parque das Na??es和Póvoa de Santa Iria在塔霍河中显示较高中位数计数，Alcácer do Sal为萨多河主要高计数位点，Mitrena和Portal dos Musgos总体最低；Alhandra表现为大肠埃希菌和肠道肠球菌中位数相对较低而总大肠菌群中位数较高。3.2 分布与空间差异：Shapiro–Wilk检验显示三种指示菌均强烈偏离正态，Friedman检验以采样活动为区组发现各位点间差异显著，Kendall’s W为0.711至0.808。3.3 河口水平比较：对每次采样活动各河口三个位点均值进行配对Wilcoxon检验，未检出塔霍河与萨多河均值显著差异，大肠埃希菌统计量=7.0、p=0.563，总大肠菌群统计量=3.0、p=0.156，肠道肠球菌统计量=3.0、p=0.156；该结果不证明两河口等效。3.4 采样活动特征与时间模式：采样活动剖面显示位点内存在明显 episodic 变异，Parque das Na??es在第1和第4次活动计数高，Póvoa de Santa Iria在第3次活动总大肠菌群达最大，Alcácer do Sal在第3次活动出现明显大肠埃希菌和总大肠菌群峰值，Portal dos Musgos在第3次活动总大肠菌群出现峰值；Kendall’s τ未发现任何位点–指示菌组合存在显著单调趋势，Mitrena总大肠菌群Kendall’s τ=0.733、p=0.056，但因采样次数少且间隔不等未解释为持续趋势。3.5 粪便指示菌之间的关联：Spearman相关分析显示所有指示菌对正相关，大肠埃希菌与肠道肠球菌最强（ρ=0.906，p<0.001），其次为大肠埃希菌与总大肠菌群（ρ=0.745，p<0.001）及总大肠菌群与肠道肠球菌（ρ=0.708，p<0.001）。3.6 多变量污染梯度：对log₁₀(x+1)转换并z标准化的计数进行PCA，PC1解释86.7%总方差，PC2解释10.4%，累计97.1%；PC1对大肠埃希菌、总大肠菌群和肠道肠球菌载荷相近（0.593、0.548、0.589），代表总体污染梯度；PC2以总大肠菌群（0.835）对比大肠埃希菌（?0.353）和肠道肠球菌（?0.422）；得分显示位点水平结构而非两河口完全分离，Parque das Na??es和高计数Alcácer do Sal位于较高污染范围，Mitrena和Portal dos Musgos趋向较低PC1，两河口观测重叠，与河口水平Wilcoxon非显著结果一致。3.7 肠道沙门菌的发生与血清型分布：培养与血清分型显示S. enterica从10/36份样本（27.8%）和五个位点回收，Mitrena全程阴性；Parque das Na??es重复回收S. Chester（第1–2次活动）和S. Infantis（第5–6次活动），Alcácer do Sal重复回收S. Schwarzengrund（第2–3次活动）；因未行分子分型，重复血清型不能确立菌株同一性。3.8 按沙门菌检出状态的粪便指示菌：探索性Mann–Whitney U检验加Holm校正显示，沙门菌阳性样本三种FIB浓度均高于阴性样本且校正后显著；但同一位点重复观测且未考虑位点内聚类，独立性假设可能违反，故该比较仍属探索性，不能说明FIB可定量预测S. enterica发生，也不能确立因果或共同来源。3.9 抗菌药物敏感性谱：对10株S. enterica分离株行纸片扩散法及EUCAST判读，8株（80%）在受试组合内无耐药记录，2株（20%）显示MDR表型；来自Póvoa de Santa Iria第3次活动的S. enterica serovar Kapemba对ampicillin、tetracycline、pefloxacin、cefoxitin、trimethoprim及trimethoprim–sulfamethoxazole耐药，来自Portal dos Musgos第3次活动的单相S. Typhimurium（1,4,[5],12:i:-）对ampicillin、tetracycline、nalidixic acid及pefloxacin耐药；二者涉及至少三类抗菌药物类别，故归为MDR。20%仅描述10株回收分离株中的表型比例，不能解释为任一河口或更广泛河口环境中MDR S. enterica的流行率；pefloxacin和nalidixic acid应视为EUCAST标准下喹诺酮/氟喹诺酮耐药的筛选表型指标，而非常规治疗敏感性类别。

讨论部分总结：该数据集最清晰特征是空间异质性，三种FIB位点差异显著且Kendall’s W较大，而配对河口均值无显著差异；河口水平聚合会混合高计数与低计数位点并掩盖局部污染，位点变异与局部源强度、排放位置、土地利用、降雨径流、盐度、沉积物相互作用和水动力输运一致，但研究未测这些解释变量，不能将单个峰值归因于特定来源；无显著单调时间趋势不应解释为时间稳定，六次活动间隔不等、覆盖不足两个月且含 episodic 峰值，不能表征季节性、年度变异性或长期趋势。三种指示菌强协变，尤其大肠埃希菌与肠道肠球菌，符合部分共享粪便输入或输运过程，但相关不能识别来源；总大肠菌群生态分布更广、对近期粪便污染特异性低于大肠埃希菌；PCA支持共享污染梯度和位点结构而非二分河口分类。S. enterica从27.8%样本和5/6位点回收，说明研究期间多数采样位置可检出该病原菌；重复血清型可符合反复输入或短期局部持续，但无基因组或其他高分辨分型不能区分克隆相关、同源或独立引入；阳性样本FIB较高仅支持监测数据集内共现，因位点内重复观测和阳性样本仅10份，不能建立预测性能、位点校正关联或因果。8/10分离株受试组合内无耐药记录，而两株来自不同河口的分离株呈MDR表型，从One Health角度具相关性，但20%不是真实流行率估计；未研究耐药基因、基因组分型或与临床、食品、动物和废水分离株比较，不能确定耐药表型来源或传播。监测上应保留空间分辨率，固定位点重复采样可识别需源调查或强化监测的位置；现有计数不能用于将采样水归类为浴用水、饮用水源或灌溉水，法规分类需目的特异采样设计、规定评估期及相应法规指南标准。未来监测应整合温度、盐度、pH、电导率、浊度、溶解氧、降水、河流流量和精确潮时，并应用源追踪标志及与废水、食品、动物和临床分离株的基因组比较。研究优势包括两河口使用同一培养流程、36份正式样本FIB数据完整、每个系统多位点采样、血清型水平表征以及区分位点效应与河口水平聚合；局限包括六次活动不足两个月且间隔不等、目的性选点、未测理化水文变量、五次低潮一次高潮且精确潮时不可用、沙门菌分离株少、FIB–病原体比较为探索性且未建模位点内重复、未行分子分型或源归因、AST仅基于分类表型且无抑菌圈直径和纸片效价供回顾性再分析。

研究结论翻译：这项短期监测研究显示，塔霍河与萨多河口六个位点的粪便指示菌存在显著空间异质性。三种指示菌的位点效应均较大，而配对河口水平各次采样活动均值未检出统计学显著差异。指示菌强相关并形成主导多变量污染梯度，但两个河口重叠，强调全系统均值的局限性。S. enterica从五个位点的十份样本中回收。探索性分析中阳性样本FIB浓度更高，但阳性样本数量少及重复位点结构排除了因果或预测性结论。十株沙门菌分离株中八株在受试组合内无抗菌药物耐药记录，而两株（每个河口各一株）显示MDR表型。这些发现构成环境抗菌药物耐药信号，但不能估计耐药流行率或识别其来源。特定位点重复回收相同血清型在无分子分型时不能证明持续存在或菌株相关性。该研究支持空间分辨的微生物监测，并为更全面监测提供透明基线。未来工作应跨季节扩展，整合理化、水文、降雨和潮汐测量，并应用分子源追踪及与人类、动物、食品和废水分离株的基因组比较。