意大利陆生食用腹足动物中疱疹病毒目（Herpesvirales）与杆状病毒科（Baculoviridae）的探索性分子筛查

《Microorganisms》：Exploratory Molecular Screening for Herpesvirales and Baculoviridae in Terrestrial Gastropods from Italy

　　

意大利蜗牛养殖近年稳步增长，受食品和化妆品行业需求增加驱动。最常养殖物种包括庭园蜗牛（Cornu aspersum）和罗马蜗牛（Helix pomatia）。尽管蜗牛养殖中出现疾病和高死亡率暴发，病原体仍表征不足。迄今，陆生腹足动物中尚无确诊病毒感染报道，尽管宏基因组研究检测到病毒序列，且地中海蜗牛（Theba pisana）中描述过病毒样感染。本研究调查意大利三个地区陆生食用蜗牛中疱疹病毒目（Herpesvirales）和杆状病毒科（Baculoviridae）的存在，包括两种养殖物种（C. aspersum和H. pomatia）和一种野生物种（Eobania vermiculata）。共81个个体提供83份生物基质（50份足组织和33份血淋巴），通过PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链反应）分析。未检测到疱疹病毒或杆状病毒。这些发现代表对意大利陆生食用蜗牛中这些病毒群的首次靶向调查，并为未来病毒学监测提供基线数据。需要进一步研究以表征病毒多样性、评估其流行病学相关性，并阐明其对蜗牛健康和养殖系统的潜在影响。

研究背景：陆生蜗牛长期供人食用，意大利蜗牛养殖（heliciculture，蜗牛养殖）因食品和化妆品需求增长而发展，主要养殖C. aspersum和H. pomatia。养殖场已报告疾病和高死亡率暴发，但病原体表征不足；陆生腹足动物迄今无确诊病毒感染，仅宏基因组检测到病毒序列，T. pisana死亡事件中曾以透射电镜观察到核内病毒样颗粒但未分子鉴定。水生软体动物中疱疹病毒目（Herpesvirales）的海洋疱疹病毒科（Malacoherpesviridae）及杆状病毒科（Baculoviridae）样颗粒有报道，但陆生腹足动物分子数据缺乏，养殖场不明死亡及食用相关病毒风险知识有限。因此，研究人员于2024—2025年在意大利三个地区对养殖和野生食用陆生腹足动物开展观察性横断面探索性分子筛查，涵盖外观健康、濒死和死亡个体及来自死亡事件养殖场的样本；结果显示所有样本均未检出目标病毒DNA，提示所检查样本中无证据支持这些病毒参与死亡事件，并提供意大利陆生食用蜗牛中这些病毒群的首次靶向调查基线数据。其意义在于填补分子数据空白，为未来病毒学监测和风险识别提供基础，但因探索性和地理不平衡，不能证明这些病毒不存在或食用安全。

关键技术方法：采用观察性横断面探索性分子筛查。样本来自意大利Piedmont、Sardinia和Campania的20个商业养殖场（Piedmont 14、Sardinia 5、Campania 1）及Sardinia 5个野生点，涵盖C. aspersum、H. pomatia和E. vermiculata；Piedmont经养殖者联盟采集的3份样本源自罗马尼亚（n=1）和克罗地亚（n=2）进口养殖种群，并包括2个2024年发生死亡事件的C. aspersum养殖场5个个体。共81个个体提供83份基质（50份足组织、33份血淋巴），按外观健康、濒死、死亡分类；两阶段采样后提取DNA，Herpesvirales采用依据VanDevanter et al.的巢式共识PCR，Baculoviridae采用通用PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳，采用描述性分析。

3. 结果：共纳入81个个体，Piedmont 69、Sardinia 10、Campania 2；养殖场20个，野生点5个；2个死亡事件养殖场5个个体（2个外观健康/活、1个濒死、2个死亡）。物种为C. aspersum（n=46）、H. pomatia（n=30）、E. vermiculata（n=5）；83份基质包括50份足组织和33份血淋巴；采样时62个活、6个濒死、13个死亡。通过PCR筛查，所有基质对Herpesvirales和Baculoviridae DNA（deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸）均阴性，且在不同物种、地区、基质和健康状态中一致，包括死亡事件养殖场5个个体。

4. 讨论与结论：讨论认为，本研究未提供所检蜗牛中存在疱疹病毒或杆状病毒的证据，尤其Piedmont和Sardinia样本较多；两个高死亡养殖场的活、濒死和死亡样本均未检出目标DNA，不支持目标病毒群参与这些暴发。作者指出采样地理不平衡，Piedmont占多数，Sardinia和Campania有限，因此结果不能代表意大利陆生腹足动物总体，也不能视为这些病毒群在调查物种中不存在。探索性和基于可得性的设计不用于估计流行率或排除低水平循环；按独立随机抽样和完美诊断灵敏度示例，81个个体在真实流行率1%和0.5%时至少检出1个感染个体的概率约为55.7%和33.4%，但这不是正式研究效能估计；低流行率可能漏检，阴性应解释为所检标本中无可检测DNA而非病毒不存在。分析性能方面，原PCR方案的分析灵敏度（≤100 genome equivalents/100 ng carrier DNA；杆状病毒100 plasmid copies）来自不同模板和基质，不能直接外推至蜗牛足组织或血淋巴，本研究未建立基质特异性检测限（limit of detection，LOD），未设内部扩增对照，不能完全排除分析灵敏度降低或样本特异性PCR抑制。与T. pisana死亡事件中电镜观察到核内病毒样颗粒但未分子鉴定、Caracolus marginella肠道宏基因组病毒序列、Achatina fulica和Pomacea canaliculata病毒富集宏基因组等研究不可直接比较；检测病毒序列不证明活动感染、组织嗜性或致病因果。水生软体动物中Malacoherpesviridae（海洋疱疹病毒科）如haliotid herpesvirus-1与鲍严重疾病和高死亡相关，Babylonia areolata中亦表征到相关疱疹病毒基因组，提示需持续监测养殖陆生蜗牛，尤其不明死亡时；但本研究不支持目标病毒群与所调查死亡事件相关，不能排除其他未表征病毒。食品安全方面，Baculoviridae为高度宿主特异性昆虫病毒，不认为感染哺乳动物；OsHV-1（Ostreid herpesvirus-1，牡蛎疱疹病毒1型）微变异株亦不认为影响人；本研究结果更相关于危害识别和动物健康监测，而非消费者风险定量评估，不能证明食用蜗牛病毒学安全。结论翻译：总体而言，在检查的陆生腹足动物中未检测到归属于Herpesvirales目或Baculoviridae科的DNA，包括来自发生死亡事件养殖场的个体。鉴于调查的探索性和地理限制，这些发现应视为初步。未来需基于更广泛和更具代表性采样、加强分子对照和非靶向病毒组学方法的研究，以更好表征陆生腹足动物病毒多样性及其对蜗牛健康和生产的相关性。