《Plants》：MicroRNA Gatekeepers: Integrating Growth, Development, and Stress Adaptation in Cotton
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作为天然纤维的主要经济作物，棉花在复杂的內源遗传程序调控下发育，生物胁迫与非生物胁迫持续驱动其适应性进化。microRNA（miRNA）是一类通过靶mRNA切割、翻译抑制及介导DNA甲基化来调控基因表达转录后水平的调控因子。miRNA靶向转录因子和激素信号通路
作为天然纤维的主要经济作物，棉花在复杂的內源遗传程序调控下发育，生物胁迫与非生物胁迫持续驱动其适应性进化。microRNA（miRNA）是一类通过靶mRNA切割、翻译抑制及介导DNA甲基化来调控基因表达转录后水平的调控因子。miRNA靶向转录因子和激素信号通路，调控棉花株型与纤维发育。此外，miRNA通过活性氧（ROS）、木质素和激素通路，以及与长链非编码RNA（lncRNA）形成竞争性內源RNA（ceRNA）模块，缓解生物与非生物胁迫。本综述建立了一个以miRNA为核心的调控框架，协调棉花生长、发育与抗逆性。研究提出了一系列技术，包括多组学结合机器学习、基因过表达、STTM、MIM、MIGS、CRISPR编辑、叶面dsRNA喷洒及生物纳米载体，以促进高产、优质纤维和广谱抗逆棉花品种的培育。
主体内容总结
2. miRNA在棉花发育调控中的作用
棉花经历营养生长和生殖生长两个基本发育过程，受内在遗传程序和環境信号协调控制。miRNA通过靶向转录因子（TF）和激素信号级联，精确调控细胞增殖与分化，作为连接发育信号与基因表达的中心枢纽。miRNA家族在调控从营养生长向生殖生长的程序性转变中发挥关键功能，介导两个发育阶段的秩序切换与动态平衡。
2.1 调控棉花种子发育的miRNA守护者
种子是作物主要收获器官，种子大小和粒重是决定产量的关键性状。棉花纤维细胞从胚珠表皮细胞起始，因此种子发育对纤维伸长、产量和品质有深远影响。miR160靶向调控ARF以激活ABA信号通路，通过直接或间接调控种子发育相关基因来调节种皮生长，从而决定种子大小。miR2947-MuTC01调控模块参与棉花胚胎发生和形态建成，精细控制胚胎折叠。miR2947靶向并介导雷蒙德氏棉中MuTC01转录本的切割，触发次级小RNA的产生，产生的22 nt siRNA靶向关键胚胎发育基因LEC2b并诱导mRNA切割，进而诱导21 nt phased siRNA（phasiRNA）的生物发生，最终调控胚胎折叠表型。
2.2 调控棉花节间伸长和腋芽发育的miRNA管理者
多种miRNA精确调控棉花营养发育，包括节间伸长和腋芽形成。在调控棉花株型和分枝的网络中，miR164通过靶向并抑制NAC转录因子基因GhSBI1塑造株型。靶位点突变使GhSBI1逃避miR164介导的切割而过表达，GhSBI1与DELLA蛋白互作抑制赤霉素（GA）生物合成和信号转导，缩短果枝节间，形成适合密植的紧凑株型。miR164-GhCUC2-GhBRC1-GhNCED1模块介导腋芽起始，促进腋芽中脱落酸（ABA）积累，抑制侧枝伸长，同样促进棉花紧凑株型形成。
2.3 调控棉花花器官育性的miRNA平衡者
花器官形成和育性是棉花产量和繁殖效率的核心决定因素，受多种miRNA精确调控。miR157-SPL调控模块调节MADS-box转录因子和生长素信号转导，参与棉花花器官发育和胚珠形成。miR3367-lncRNA67-GhCYP724B通路通过调控油菜素甾醇（BR）生物合成直接影响棉花雄性育性，诱导雄性不育。miR156和miR828通过抑制SPL9家族成员和MYB转录因子调控花青素生物合成，积累的花青素清除活性氧（ROS），从而影响花器官和纤维发育。miR156、miR390、miR160、miR167和miR393共同参与生长素信号调控，其中miR167作为网络核心枢纽，通过靶向ARF6/8负调控生长素信号。miR159、miR2950和miR172参与GA信号转导，作用于GAMYB、关键GA生物合成酶和Scarecrow-like家族基因。生长素和GA信号通路与花青素代谢通路协同作用，调控花器官和纤维发育。
2.4 协调棉花纤维伸长的miRNA
棉花是全球最重要的天然纤维作物，纤维发育受复杂分子机制调控，miRNA可在不同发育阶段精细调节纤维伸长。miR828和miR858通过调控GhMYB2影响纤维起始。miR396b直接靶向GRF5正调控纤维生长。miR160a_A05通过抑制ARF17和GH3表达调控纤维发育。miR167-ARF调控模块作为核心枢纽，以剂量依赖方式精确控制棉花纤维细胞的增殖和伸长。纤维起始后GhHOX3表达水平快速上调，GA至少部分通过GhHOX3促进纤维细胞伸长。miR319丰度下降，其靶基因GhTCP4及其他TCP家族基因表达逐渐升高，TCP蛋白抑制GhHOX3功能并促进次生细胞壁（SCW）生物合成，从而介导纤维从伸长阶段向次生壁增厚阶段的转变。
3. miRNA介导的棉花生物胁迫信号调控
棉花常遭受真菌、病毒和昆虫等生物胁迫，损害产量和品质。miRNA作为转录后调控因子掌控棉花免疫，解析此类网络有利于抗性育种。
3.1 真菌胁迫下棉花miRNA重编程与双向sRNA通讯
大丽轮枝菌（V. dahliae）是一种半活体营养型土传真菌病原体，经根部侵染植物，在维管系统内定殖和增殖，最终诱导宿主萎蔫症状。受V. dahliae侵染后，棉花通过调节水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、ROS、NBS-LRR蛋白、木质素、胼胝质和花青素以及SPL转录因子通路来响应黄萎病胁迫。miR166b、miR171a、miR319b、miR477、miR482b和miR530分别切割下游靶基因GhHB14、GhSCL6、GhTCP4-like、GhCBP60A、GhRSG2和GhSAP6，通过SA信号通路介导棉花抗黄萎病。miR7814调控GhCNL2的切割效率，促进GhICS1、GhEDS1和GhPAD4表达，从而调节SA和ROS水平。与SA通路平行，miR164通过切割靶mRNA抑制GhNAC100表达，解除其对JA信号的抑制作用并激活JA介导的防御反应。miR398b减轻对GhCSD1、GhCSD2和GhCCS1的切割以维持植物ROS稳态。V. dahliae侵染阻断miR482c介导的GhRDUF4D mRNA降解，导致GhRDUF4D显著上调，作为E3泛素连接酶促进底物泛素化，触发ROS爆发和胼胝质沉积，有效抑制病原体定殖和扩散。来源于V. dahliae的VdsRNA靶向miR157d前体MIR157d，在受侵染棉花中提高miR157d积累，差异上调的miR157d靶向并抑制SPL13A/B以调控棉花开花转变，从而延长植物营养生长阶段。这种跨界sRNA通讯发生在不同物种之间，区别于棉花细胞内的內源ceRNA调控模块。
棉花枯萎病由尖孢镰刀菌萎蔫专化型（Fov）引起，也是一种全球性破坏性土传病害。从Fov菌丝和微菌核中鉴定的miRNA在这两个发育阶段表现出不同的表达模式，这些miRNA是Fov內源的而非棉花miRNA。Fov侵染棉花后，GhMKK6-MAPK通路被激活，主要通过SA和/或JA通路触发防御反应。miR5272a在转录后水平负调控GhMKK6，形成负反馈环以防止过度免疫并维持稳态。
3.2 棉花-病毒互作中的miRNA串扰
棉花叶卷曲病（CLCuD）是由棉花叶卷曲双生病毒复合体经烟粉虱传播的毁灭性病毒病。研究表明，通过采用內源miRNA调控策略，陆地棉中过表达miR398和miR2950可靶向棉花叶卷曲木尔坦病毒（CLCuMuV）及其伴随的卫星DNA（CLCuMB）基因组，显著增强棉花对叶卷曲病的抗性。棉花內源miR156b靶向并抑制多个SPL家族转录因子基因表达，通过CLCrV载体在陆地棉中瞬时过表达miR156会触发植物发育缺陷，包括严重叶片皱缩、幼叶下卷和植株矮化。
3.3 塑造棉花-害虫互作的miRNA线索
棉花害虫分为三类：以烟粉虱为代表的刺吸式害虫、以根结线虫为代表的植物寄生线虫和以棉铃虫为代表的咀嚼式害虫。miR390切割TAS3转录本产生tasiRNA，进一步调控生长素响应因子ARF8，形成linc1-miR390-TAS3级联模块，通过抑制生长素信号同时激活JA信号的串扰调控显著增强棉花对烟粉虱的抗性。现有关于棉铃虫等咀嚼式害虫的研究多集中于害虫內源miRNA，而非宿主棉花miRNA的机制分析。
4. miRNA介导的棉花非生物胁迫响应
干旱、盐碱、极端温度和重金属等非生物胁迫严重限制棉花生长和产量。miRNA作为连接环境信号与植物适应性反应的核心调控枢纽，通过调节胁迫响应基因表达、抗氧化系统活性、离子稳态和激素信号通路，促进棉花对逆境环境的适应。
4.1 棉花干旱适应中的miRNA调控模块
干旱是大幅降低棉花纤维产量并阻碍棉产业可持续发展的主要非生物胁迫。在抗旱棉花种质中已鉴定379个干旱响应miRNA。miR477b作为棉花耐旱性的主调控因子，直接靶向两个转录因子GhNAC1和GhSCL3。干旱诱导的长链非编码RNA（lncRNA）DRL1作为竞争性內源RNA（ceRNA）竞争性隔离miR477b，减轻其对下游靶基因的抑制。该ceRNA调控模块激活多条胁迫通路，提高植物水分利用效率，稳定细胞膜结构，提升抗氧化能力，最终大幅增强棉花幼苗的耐旱性。此外，已鉴定9个靶向7个蜡质合成GhCER基因的miRNA，形成与ERF和MYB转录因子关联的级联调控通路。
4.2 miRNA精细调控棉花盐胁迫响应
盐胁迫引发细胞脱水、离子毒性和大量ROS积累等一系列生理反应。高浓度NaCl下棉花叶片中12个miRNA下调，根部miRNA表达谱与叶片存在显著差异。盐胁迫诱导miRNVL5切割并抑制GhCHR，从而抑制胁迫响应转录因子，导致SOS1下调和多个盐响应基因诱导，最终引发K?/Na?比值失衡，增加棉花对盐胁迫的敏感性。相反，miR414c在盐胁迫下下调，解除对其靶基因GhFSD1的抑制，GhFSD1表达升高增强SOD活性，加速ROS清除，减轻细胞膜损伤，从而提高棉花耐盐性。miR390-GhCEPR2模块通过ABA信号通路调控棉花耐盐性。
4.3 miRNA介导的棉花温度胁迫稳态调控
全球变暖带来低温和高温两种极端温度胁迫。高温胁迫下miR160的诱导具有基因型依赖性：在热敏感棉系H05中miR160被高温上调，而在耐热棉系84021中其表达被抑制。转基因实验证实miR160靶向并抑制ARF10/17，异常激活生长素信号通路，最终触发花药不开裂。高温同时抑制两个棉系中miR156/157的转录，导致下游SPL家族基因表达升高，进一步诱导小孢子败育。这两条通路协同作用诱导棉花花药雄性不育。热胁迫下调miR156和miR8643，解除其对膜受体样激酶基因PERK12和RBK1的切割抑制，这两个基因转录本丰度显著增加破坏花粉育性稳态。热诱导的miR167和miR390切割靶基因Bp10，抑制ROS清除通路相关基因，扰乱细胞内氧化稳态。miR167还可进一步靶向并切割关键生长素信号基因ARF8，改变下游靶标转录本丰度，破坏JA代谢平衡，最终通过未阐明的分子机制导致花药异常开裂和花粉败育。miR482/2118超家族成员触发21 nt生殖phasiRNA的生物发生，进一步调控棉花育性恢复过程。高温还激活miR396-PME31模块重塑戊糖和葡萄糖醛酸互变代谢。
4.4 重金属胁迫下棉花中的miRNA串扰
铅和镉是两种高毒性重金属，易在土壤中积累并被棉花吸收，通过损伤光合色素和降低叶绿素含量破坏正常生长发育。在镉耐受和镉敏感棉花材料中鉴定出35个镉（Cd）胁迫响应miRNA，包括miR159、miR167、miR172和miR390，它们靶向与细胞壁、胁迫响应、离子转运、光合作用和激素信号通路相关的基因，调控棉花对Cd胁迫的表型响应。
4.5 调控棉花养分失衡的miRNA调控回路
棉花生长、产量形成和纤维品质发育高度依赖大量元素和微量元素的充足供应。在氮胁迫下，上调的miR156、miR167和miR390分别靶向并抑制SPLs、ARFs/IAR?和ARFs以触发侧根起始；下调的miR393解除对生长素受体TIR1/AFBs的切割抑制，最终抑制侧根发育。高积累的miR171和miR396转录本分别负调控SCL和GRFs，协同促进主根纵向伸长，使棉花在低氮条件下形成侧根减少、主根伸长的适应性根构型。miR44抑制新型锌转运蛋白基因GaZIP1L的转录，调控胚珠发育过程中的锌转运效率。高硼处理显著诱导棉花中miR408上调，通过调节铜离子稳态和细胞壁木质化，间接改变硼转运蛋白BOR1/BOR2和水通道蛋白PIP1;1/PIP2;1的转录水平，建立miR408-铜稳态-硼转运级联调控通路以提高棉花对硼毒性的耐受性。
5. 棉花中保守的miRNA调控因子：整合生长-防御响应
作为多效性调控因子，miRNA协调作物生长与免疫防御，同时参与植物发育和生物胁迫响应。
5.1 双功能miRNA模块：棉花生长发育与生物胁迫信号之间的权衡
植物在病原体侵染时经常表现出生长抑制，这一现象称为生长-防御权衡。miR319c靶向GhMYB33并调控下游生长和防御相关基因（包括GhSPL9和GhDFR1），平衡棉花生长与抗病性。双功能的miR397-GhLAC4模块调控动态木质素代谢：在非胁迫条件下维持基础木质素合成以支持正常植物生长；受V. dahliae侵染后，通过GhLAC4诱导大量木质素产生以增强棉花对病原体的防御。
5.2 miRNA：棉花生长发育与非生物胁迫的共调控枢纽
miR160和miR167依赖ARF靶向网络以剂量依赖和时空特异方式发挥多效调控，参与生长和胁迫响应的协调调控。miR160靶向ARF家族基因，参与ABA和生长素信号，在种皮发育、纤维形成、高温响应和盐胁迫适应中发挥多重功能。盐胁迫下lncRNA354可隔离miR160b以解除对ARF17/18的抑制，协调根系发育和耐盐性。miR167-ARF模块同样具有多效性，参与生长素和赤霉素信号及花青素代谢网络，以剂量依赖方式调控棉花纤维细胞的增殖和伸长，同时响应高温和氮缺乏等胁迫，通过生长素-JA串扰和ROS稳态平衡生殖育性和根系可塑性。
5.3 miRNA响应：棉花生长发育与胁迫响应的信号枢纽
miR156以SPL通路为中心，以时空特异方式协调生长和抗逆性。病毒感染、高温和氮限制改变miR156的转录本丰度，调控SPL及下游PERK12参与小孢子发育、花粉育性维持和侧根形成。miR390通过linc1-miR390-TAS3级联、ABA信号和氧化还原稳态通路介导对烟粉虱侵害、盐胁迫、高温、镉胁迫和氮缺乏的响应，在不同环境下切换生长素和JA信号输出，差异调控根系发育和抗逆性。
6. 未来展望与策略
基于miRNA调控网络的多维技术体系对于提高棉花胁迫适应性和农艺性状至关重要。多组学联合机器学习已展示出克服单一组学方法局限性的能力，可实现miRNA调控模式、胁迫响应基因和TF-miRNA-靶标通路的鉴定。miRNA过表达、模拟靶标（MIM）、短串联靶标模拟（STTM）、miRNA诱导基因沉默（MIGS）和CRISPR编辑等工具促进miRNA功能的精确调控。双链RNA（dsRNA）喷洒结合生物纳米技术已在多种作物中显示出病害防控潜力，但在棉花中仍处于实验室研究阶段。
6.1 组学驱动的智能算法系统挖掘miRNA及其靶基因
全长转录组、翻译组、多聚核糖体分析、小RNA测序、植物RNA原位构象测序（pRIC-seq）和降解组测序等先进多组学方法促进miRNA调控棉花发育和胁迫响应的研究。pRIC-seq生成二倍体和四倍体棉花全基因组RNA互作图谱并揭示空间RNA调控。转录组-降解组联合分析已鉴定43个与镉耐受相关的miRNA靶标。在拟南芥中，整合时间序列小RNA和单细胞转录组数据已构建高分辨率TF-miRNA-基因网络。受棉花复杂异源四倍体基因组和物种特异性miRNA调控回路限制，在拟南芥中建立的TF-miRNA-基因网络单细胞分析框架尚未在棉花中完全构建。机器学习为整合多组学挖掘提供计算方法，以筛选调控棉花生长和抗逆性的候选基因和优良等位基因。
6.2 棉花中miRNA介导的靶基因调控机制
mRNA切割是miRNA作用的主要转录后模式，可通过降解组测序和5′-RACE验证。除靶mRNA切割外，miRNA还发挥翻译抑制作用，调控木质素、类黄酮和ROS通路以调节纤维发育和生物抗性响应。同时，miRNA可激活RdDM依赖性表观遗传沉默以稳定农艺性状并增强棉花胁迫适应性。棉花中miRNA调控通路之间的动态串扰仍不清楚，PHAS来源的siRNA仅在组学水平上被部分表征，RdDM依赖的胁迫记忆遗传性在棉花中仍缺乏充分的体内功能实验证据。
6.3 多技术协同实现精确基因功能调控：过表达、MIM、STTM、CRISPR和MIGS
植物miRNA功能研究的主要工具包括过表达、MIM、STTM、MIGS和CRISPR编辑。前体过表达产生功能获得系，棉花中miR319c平衡植物生长与黄萎病抗性，miR398b和miR482b调控棉花对V. dahliae的免疫。MIM和STTM抑制成熟miRNA活性以解除对靶基因的抑制，而MIGS可实现多基因同时沉默。STTM164隔离miR164，上调GhCUC2，调控侧枝发育和腋芽ABA积累。MND-Cas9系统移除miRNA茎环结构实现完全基因敲除，CRISPR/Cas12a介导miRNA前体和miRNA结合位点的多重编辑，RNA靶向的Cas13d在转录后水平介导可逆和瞬时调控。
6.4 外源叶面dsRNA施用与纳米颗粒递送系统
外源施加的合成dsRNA被植物Dicer样酶加工产生dsRNA来源的siRNA，靶向病原体转录本、沉默致病基因并减弱真菌毒力。该RNA基础防御已在拟南芥和番茄中得到验证。然而，裸dsRNA在环境中不稳定且易降解，棉花细胞对dsRNA摄取效率低，极大限制了RNA介导病害防控的田间表现。生物纳米技术为克服这些瓶颈提供了可行且环境友好的解决方案。研究者设计了人工miRNA（si-tsRVal）并装载到Fe?O?磁性纳米颗粒（MNPs）上形成稳定球形复合物（MNP-si-tsRVal），通过叶面喷洒将该复合物高效递送至苹果叶细胞，抑制靶向苹果抗病基因MdTIR-1的tsRVal积累，增强苹果对早期落叶病的抗性。基于星形聚阳离子（SPc）的纳米载体递送系统装载miR393可激活JA和SA信号通路，抑制生长素受体基因表达，诱导PR1大量积累，增强番茄对灰霉病的抗性。
7. 结论
miRNA作为调控网络中的核心分子"守门人"，是连接发育和胁迫信号的关键枢纽，表现出多效功能：调控种子、株型和纤维的发育过程；介导棉花对生物和非生物胁迫的响应；通过miRNA劫持效应调控生长-防御权衡。除陆地植物中高度保守的miRNA模块外，棉花还进化出谱系特异性miRNA（miR2947、miR44），多个保守miRNA通路已发生功能新化。miR319-TCP和miR828-MYB等保守模块已获得棉花特异的纤维细胞命运决定功能。此外，棉花-V. dahliae互作中发生独特的跨界小RNA调控事件。这些谱系特异性sRNA事件支撑棉花特有的生物学性状，其调控机制不能直接从拟南芥等模式植物研究中推断。基于miRNA的棉花遗传育种面临多重瓶颈：大多数调控模块缺乏植物体内遗传功能证据；联合胁迫条件下ceRNA-phasiRNA调控回路机制尚不清楚；基因编辑技术也存在一定应用限制。未来应解析miRNA劫持效应背后的分子开关，为培育平衡产量、纤维品质和广谱抗逆性的棉花新材料提供理论支持。
