四种禾本科植物FLA基因家族比较基因组学解析及谷子SiFLA6盐碱耐受功能鉴定

《Plants》：Analysis of FLA Gene Family in Four Poaceae Species and Functional Characterization of SiFLA6 in Saline–Alkali Tolerance

　　

成束蛋白样阿拉伯半乳聚糖蛋白（Fasciclin-like arabinogalactan proteins，FLAs）在植物界普遍存在，并在植物生长发育全生命周期中发挥关键作用。为获得有价值的遗传学认识并系统解析FLAs的生物学功能，研究人员对谷子、青狗尾草、柳枝稷和高粱四种禾本科植物FLA基因家族进行了全面的全基因组分析，并对关键候选基因进行了功能表征。在四种物种中共鉴定到121个FLA家族成员。系统发育树分析将这些FLAs分为4个明显亚家族，其中基因表现出高度保守的基因结构和保守基序。多数FLA基因启动子含有丰富的与胁迫和激素响应相关的顺式作用元件。此外，克隆了盐碱耐受相关候选基因SiFLA6，并通过遗传转化获得T3代纯合过表达株系（OE-1和OE-2）。利用OE-1株系进行亚细胞定位检测，证实SiFLA6定位于内质网。表型分析显示，在盐碱胁迫下OE-1和OE-2株系的根生长受抑制程度低于野生型拟南芥（WT）。与表型变化一致，与WT植株相比，OE-1株系表现出显著更高的地上部鲜重和干重生物量、叶绿素含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性，并具有更高的K⁺/Na⁺和Ca²⁺/Na⁺比值。相反，过表达株系中H₂O₂和丙二醛（MDA）积累显著降低。综上，这些结果表明SiFLA6过表达提高植物盐碱耐受性。

研究背景与意义：FLA（fasciclin-like arabinogalactan proteins，成束蛋白样阿拉伯半乳聚糖蛋白）是AGP（arabinogalactan proteins，阿拉伯半乳聚糖蛋白）的一个亚类，含FAS结构域，多数具有N端信号肽（signal peptide，SP）和C端GPI（glycosylphosphatidylinositol，糖基磷脂酰肌醇）锚定，广泛参与植物生长发育和非生物胁迫响应。然而，已有FLA研究多集中于拟南芥等草本植物，禾本科物种尤其是谷子、青狗尾草、柳枝稷和高粱四种C4禾本科植物中FLA基因家族的进化关系及谷子FLA基因的胁迫响应功能认识不足；盐碱地高盐高pH显著抑制植物生长并造成作物减产，因此解析FLA调控作物耐盐碱的机制对耐盐碱品种选育具有重要意义。基于此，研究人员对四物种FLA家族开展全基因组比较分析，并克隆盐碱耐受相关候选基因SiFLA6，通过拟南芥过表达进行功能验证，发现SiFLA6过表达提高盐碱耐受性，为FLA基因鉴定和标记辅助育种提供候选遗传资源。

技术方法概括：研究人员以BLASTp与HMM（Hidden Markov Model，隐马尔可夫模型）模型PF02469联合筛选并经SMART/InterPro验证鉴定FLA成员；用MEGA 11邻接法（neighbor-joining，NJ）建树，TBtools/MEME分析基序与结构，MCScanX分析共线性，DnaSP V5.0计算Ka/Ks，TimeTree/TBtools分析基因获得与丢失，PlantCARE预测顺式元件。转录组队列为GSE278652（JK3与B175盐碱0、12、24 h）及NCBI的PRJNA756390、PRJEB21225、PRJNA772942、PRJNA751769。克隆SiFLA6并经农杆菌介导获得T3代纯合过表达株系OE-1、OE-2，激光扫描共聚焦检测eGFP定位，开展海水胁迫表型、生理生化、离子与qRT-PCR分析。

研究结果：2.1 理化性质：通过BLASTp与HMM模型PF02469联合筛选并经SMART/InterPro验证，在四物种中分别鉴定24、25、26和46个FLA成员；蛋白长度192–495 aa，等电点（pI）5.02–11.72，57%为碱性蛋白，多数不稳定指数>40，111个含信号肽、55个含跨膜区。2.2 系统发育、保守基序和基因结构分析：通过NJ系统发育树、MEME基序和基因结构分析，将FLA分为A–D四组，A组最大、D组最小；同亚家族跨物种结构相似，同物种不同亚家族变异大；鉴定10个保守基序，基序8/10仅B组，基序5限于B/C组；42个成员含内含子。2.3 染色体分布、复制模式和共线性分析：通过染色体定位、复制事件和共线性分析，SiFLAs与SvFLAs分布于9条染色体，第9条最少，第8条无；SbFLAs分布于10条染色体，第5条无；PvFLAs分布于18条染色体，Chr08K和Chr08N无；四物种均有串联簇；鉴定75个复制基因对（63片段、12串联），多数Ka/Ks<1提示纯化选择；柳枝稷与谷子同源对最多70，拟南芥最少4；SiFLA4、SiFLA7、SiFLA15、SiFLA17在六个其他物种有同源。2.4 进化关系与顺式作用元件分析：通过八物种基因获得/丢失分析和启动子顺式元件预测，总丢失141略多于获得140，家族整体收缩，单子叶丢失更明显；小麦扩张最明显净增40失17，水稻收缩最严重增1失14；顺式元件分光、激素、胁迫、生长发育四类；ABA响应、低温诱导和分生组织表达元件几乎存在于所有FLA基因。2.5 多种非生物胁迫下SiFLAs表达模式及GO富集分析：通过盐碱转录组（JK3与B175在0、12、24 h）及其他四种胁迫转录组和GO（Gene Ontology，基因本体）富集，检测到21个盐碱表达基因，SiFLA5、SiFLA6、SiFLA20在JK3 12 h高表达，SiFLA4、SiFLA21在24 h高表达而B175低，选为候选；干旱20个、热15个、除草剂15个、遮阴17个；GO富集于植物型次生细胞壁生物发生、根发育、膜锚定、质膜和多糖结合等。2.6 SiFLA6克隆、系统发育与亚细胞定位：通过克隆、序列比对、系统发育和OE-1亚细胞定位，仅SiFLA6 CDS可扩增；SiFLA6与黍（Panicum miliaceum）RLM69277.1最近，N/C端变异大而中央区保守；定位于内质网。2.7 SiFLA6盐碱耐受功能分析：通过海水浓度梯度萌发和50%海水苗期胁迫，OE-1和OE-2根长受抑较轻，40%海水差异最明显；OE-1中SiFLA6高表达；50%海水下OE-1叶片黄化萎蔫较轻，鲜重、干重和SPAD（叶绿素相对含量）较高。2.8 SiFLA6介导盐碱耐受的生理机制：通过生理和离子测定，OE-1的H₂O₂和MDA较低（120 h分别低45%和61%），SOD/POD/CAT较高（120 h SOD/POD约2倍、CAT 1.2倍），Pro较高（96 h 1.6倍）；Na⁺较低（120 h低42%），K⁺/Na⁺较高（120 h 2.5倍），Ca²⁺/Na⁺较高，Fe/Zn/Mn/Cu维持较高。

讨论部分总结：3.1 四物种FLA进化特征方面，多数成员含信号肽；四物种FLA成员数虽多于拟南芥，但C组成员少于拟南芥，显示高等植物FLA多样性；仅33%含内含子，与杨属/柳属和烟草相近，提示FLA内含子多在植物进化中丢失；柳枝稷较大的FLA家族可由其异源四倍体起源解释；多数复制对Ka/Ks<1，提示纯化选择与功能保守；SiFLA4、SiFLA7、SiFLA15和SiFLA17为跨物种保守基因，其功能有待研究。3.2 SiFLAs参与非生物胁迫：启动子含激素、胁迫、光和生长发育相关顺式元件；多种胁迫下表达变化；盐碱下SiFLA基因呈时序表达，可能先初始响应后适应，与SbFLA和ZmFLA观察一致。3.3 SiFLA6增强盐碱耐受：OE-1维持高表达，促进根生长和生物量，提高SPAD；降低H₂O₂和MDA，提高SOD/POD/CAT和Pro；降低Na⁺积累，维持较高K⁺、Ca²⁺及Fe、Zn、Mn、Cu，改善K⁺/Na⁺和Ca²⁺/Na⁺；讨论部分引用Zang et al.、Modareszadeh et al.和Bashir et al.等的结果支持相关观点。原文同时指出SiFLA6是否直接调控离子稳态或抗氧化能力尚待研究，且定位需内质网标记进一步确认，SiFLA表达需qPCR验证；FLA基因可作为标记辅助育种候选遗传资源。

研究结论翻译：本研究在四种禾本科物种中鉴定出121个FLA家族成员并分为4个亚家族；FLA家族进化主要受纯化选择驱动；FLA基因含有多种与非生物胁迫响应相关的顺式作用元件。海水处理下，OE-1株系表现出更高的K⁺/Na⁺和Ca²⁺/Na⁺比，Na⁺积累降低而K⁺积累相对保持，并维持较高Ca²⁺、Mg²⁺、Cu、Fe、Zn和Mn浓度（尤其在48 h后）。此外，OE-1株系增强SOD、POD和CAT活性，促进Pro积累，并降低MDA和H₂O₂含量。综上，这些发现表明OE-1的离子和氧化还原平衡受干扰较小，提示SiFLA6是拟南芥响应盐碱耐受性的正调控因子。