六倍体Elymus tsukushiensis卫星重复序列的染色体组织与亚基因组分化

《Plants》：Chromosomal Organization and Subgenomic Differentiation of Satellite Repeats in Hexaploid Elymus tsukushiensis

　　

六倍体禾草Elymus tsukushiensis（2n = 42, ^StStHHYY）为研究异源多倍体基因组中重复DNA的染色体组织与亚基因组分化提供了适宜体系。在本研究中，研究人员以源自卫星DNA的16个先前表征的重复家族（E1–E16）作为荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）探针确定其染色体定位，随后利用Oligo-HvCSR和St2-80探针鉴定H、St和Y亚基因组。FISH定位揭示了亚基因组间的显著差异：E7和E9的大阵列与St亚基因组相关；E10仅在Y染色体上检测到；E12和E16显示偏好定位于H亚基因组；其余重复序列呈两亚基因组或多亚基因组分布。将FISH模式与先前建立的相对拷贝数进行比较显示，数量丰度与物理组织并非严格成比例：E9的高拷贝数与一对St染色体上的局部聚集相一致，而E16的低丰度并不妨碍主要H亚基因组中可重复FISH位点的形成。重复组（repeatome）分析表明，重复DNA占E. tsukushiensis基因组的50.36%，包括38.42%移动元件（mobile genetic elements）和1.41%卫星DNA。研究结果表明，结合定量与细胞遗传学方法可更完整地表征卫星重复序列的亚基因组组织，并鉴定E9、E10、E12和E16作为在小麦族中进一步评估的候选细胞遗传学标记（cytogenetic marker）。

Elymus L. sensu lato是小麦族（Triticeae）中最复杂的异源多倍体类群之一，约150–200种，基因组组织包含St、H、P、W和Y等基本单倍型组合；St和H单倍型分别与Pseudoroegneria和Hordeum系统发育相关，而对应Y单倍型的二倍体代表尚未发现。六倍体Elymus tsukushiensis Honda（2n = 42, ^StStHHYY）属于该群，是研究异源多倍体基因组中重复DNA染色体组织与亚基因组分化的适宜模型。重复DNA在小麦族基因组中占比较大且高度动态，卫星DNA（satellite DNA）为串联组织重复家族，其拷贝数和染色体组织差异显著；当前观点将卫星DNA视为动态系统，即同源重复家族在相关基因组谱系中维持，同时伴随个别阵列的独立扩增、减少和结构重排。多倍体小麦、Hordeum代表及Pseudoroegneria近缘St基因组物种中已记录同源重复家族拷贝数和染色体定位的显著差异。卫星DNA演化涉及不等交换、复制滑移、基因转换、滚环扩增及与转座元件关联等过程；在异源多倍体中，亚基因组间差异可能源于祖先谱系遗传，也可能源于异源多倍化后的重复丰度和染色体组织变化，因此仅凭拷贝数或FISH模式不能明确判定机制和发生时序。Elymus中重复序列已用于基因组分化研究，但系统比较大量卫星家族定量representation与其在单一StHY基因组中的染色体定位仍不充分。此外，单个植株或accession的FISH模式不一定为物种固定特征；Elymus nutans Griseb.存在FISH模式群体内和群体间变异，Pseudoroegneria libanotica Hack的accession间亦存在串联重复染色体分布变异，因此需以多植株、多accession及必要时不同群体或地理来源材料评估稳定性。Y单倍型起源是Elymus演化争议问题之一，分子细胞遗传数据显示St与Y亚基因组某些重复DNA组分高度相似，而E. nutans染色体水平组装将Y置于由Dasypyrum和Thinopyrum代表的V/Jv分支姐妹位置。研究人员前期跨小麦族比较E1–E16，表征其种间拷贝数变异及与特定基因组组分的关联程度，但定量数据不能确定主要重复阵列是否偏好定位于特定亚基因组。由此提出假设：E1–E16卫星重复家族在E. tsukushiensis的St、H、Y亚基因组间染色体组织不同，且全基因组数量丰度不一定预测其主要染色体阵列的亚基因组定位。研究目的为：表征E. tsukushiensis重复组；用FISH确定E1–E16染色体定位并将染色体归属H、St、Y亚基因组；将FISH模式与既往相对拷贝数比较；评估单个重复家族作为亚基因组相关细胞遗传学标记的潜力。研究人员开展上述研究后得出，重复DNA占基因组50.36%，其中移动元件38.42%、卫星DNA1.41%；FISH显示E7和E9大阵列与St相关、E10仅Y、E12和E16偏好H，其余呈两或多亚基因组分布；定量丰度与物理组织非严格成正比；E9、E10、E12和E16为候选细胞遗传学标记。其意义在于联合定量与细胞遗传学方法更完整表征卫星重复的亚基因组组织，并为小麦族异源多倍体重复DNA演化与细胞遗传标记开发提供依据。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员以E. tsukushiensis W6 PI 283170（2n = 42, ^StStHHYY；源自日本，由USDA-ARS种质资源信息网络（GRIN）提供）为材料。采用低覆盖短读长测序，经RepeatExplorer2及TAREAN分析重复组；以E1–E16单体序列为FISH探针，在根尖中期染色体进行FISH，并对同一玻片顺序再杂交Oligo-HvCSR与St2-80以划分H、St、Y亚基因组，每个重复至少观察10个中期展片；定量比较采用既往qPCR（quantitative PCR）获得的相对拷贝数（log₁₀转换），未进行新的qPCR测量。

2.1 重复组结构（Repeatome Structure of E. tsukushiensis）：通过低覆盖短读长测序及RepeatExplorer2聚类，研究人员得出E. tsukushiensis重复序列总量为50.36%；移动元件占38.42%，以I类逆转录转座子（retrotransposons）为主（36.87%），其中Ty3/Gypsy和Ty1/Copia超家族最丰富；卫星重复占1.41%，45S和5S核糖体DNA分别占0.37%和0.06%，未分类及其他重复序列占10.10%；E1–E16为16个卫星DNA家族。

2.2 亚基因组鉴定（Identification of Subgenomes in E. tsukushiensis）：通过比较Oligo-HvCSR和St2-80的FISH杂交模式，研究人员将染色体归属三个亚基因组：具有显著着丝粒Oligo-HvCSR信号和弱分散St2-80信号者为H亚基因组；具有沿染色体分布的强St2-80信号、尤其亚端粒明显簇，且一对染色体可带额外Oligo-HvCSR信号者为St亚基因组；缺乏特征性着丝粒Oligo-HvCSR信号、无强St2-80信号且仅有主要位于末端区域的弱分散信号者为Y亚基因组。

2.3 卫星重复簇E1–E16的FISH定位（FISH Localization of Satellite Repeat Clusters E1–E16）：通过E1–E16探针FISH及同一玻片顺序再杂交鉴定亚基因组，研究人员发现这些重复形成分散和局限信号，亚基因组分布、位点数、位置和强度不同。E7仅定位于两对St染色体；E9在一对St染色体短臂呈强近端信号；E10仅定位于Y染色体五对；E12在H亚基因组信号最强，并见于一对St和一对Y染色体；E16主要定位于六对H染色体，并在一对Y染色体短臂见近端信号；E13在所有染色体间质区分散；E11见于13对染色体；E15见于所有染色体且H信号最强；E14见于St和Y；E2见于H和St；E4在所有H及部分St、Y染色体有众多信号；E3以St信号最强；E8以亚端、近端和远端信号为主；E6和E1见于H、St、Y。总体形成从单亚基因组大阵列到两或多亚基因组分布的谱系；E7、E9与St，E10与Y，E12、E16与H关联最明显。

2.4 重复序列E1–E16的比较丰度与染色体分布（Comparative Abundance and Chromosomal Distribution）：通过将FISH结果与既往qPCR相对拷贝数比较，研究人员得出E. tsukushiensis中log₁₀相对拷贝数范围为?0.2（E16）至5.8（E4），E6为5.0、E11为4.5、E9为4.2、E12为4.2、E2为4.1，E8为0.7、E16为?0.2。E7在E. tsukushiensis为3.6，与P. spicata的3.6和P. tauri的3.2相近，而H. vulgare为?0.3；E9为4.2，高于P. spicata的2.0、P. tauri的2.4及H. vulgare的?1.0；E10为3.5，二倍体代表为1.2–1.8；E4和E12在E. tsukushiensis亦较高。比较表明数量丰度与物理组织并非严格成比例：E9高拷贝与一对St染色体局部大阵列并存，E16低丰度仍形成主要位于H的可重复FISH位点，E10的种间数量关联与主要阵列亚基因组定位不匹配。

讨论部分总结：E. tsukushiensis W6 PI 283170重复组以逆转录转座子为主，尤其Ty3/Gypsy和Ty1/Copia，与小麦族既往研究一致；卫星DNA占比仅1.41%，但单个卫星家族显示显著染色体分化，说明重复DNA家族的演化意义不由其对基因组大小的贡献单独决定，数量较少的组分也可发生明显染色体和亚基因组特异性分化。E. tsukushiensis重复DNA估计值50.36%低于E. sibiricus的82.49%和E. nutans的83.89%，可能部分反映重复鉴定流程差异：本研究基于低覆盖短读长测序和RepeatExplorer2聚类，而非完整基因组组装注释；低丰度或高度分化重复可能未被检出或分类不全，未分类及其他重复占10.10%，故该值应视为流程依赖性估计而非穷尽评估。P. spicata、P. tauri和H. vulgare被视为St和H基因组谱系代表而非E. tsukushiensis亚基因组的直接祖先，尤其H组分因Elymus中H谱系复杂演化史需谨慎；这些比较提供种间重复丰度变异信息，但不能重建祖先重复组织或鉴定异源多倍化特异变化。qPCR相对拷贝数表征可扩增拷贝的总representation而不论染色体位置，FISH揭示局部聚集位点及其染色体位置；FISH强度还受串联组织、局部重复密度、序列同质性和探针可及性影响，故高丰度重复可集中于少数位点，低丰度重复仍可形成可检测阵列；FISH无信号不应解释为该亚基因组完全缺失对应序列，个体拷贝或小簇可低于细胞学检测阈值。E7在St代表中拷贝数高且大FISH阵列仅见于两对St染色体，符合其与含St/StY基因组组合的关联；E9在E. tsukushiensis拷贝数显著高于所选二倍体代表而强信号仅一对St染色体，说明高总丰度可与有限位点局部积累相关；E4高拷贝且广泛分布于三个亚基因组，表明同一多倍体基因组内卫星家族可沿不同演化轨迹，即表达增加可与特定阵列局部扩大或染色体广泛分布相关。E1–E16染色体组织多样性符合卫星DNA动态组分观点，相关谱系可保留相似重复家族但丰度和阵列排列显著不同；异源多倍化将先前独立演化基因组汇于同一核内，观察到的St、H、Y差异可能源于祖先基因组分化或异源多倍化后变化，但单一现存accession分析不能区分这些情形或确定变化时序和方向。E2和E14显示部分亚基因组分化，E2主要阵列在H和St，E14在St和Y；相关序列见于其他小麦族类群，故同一重复家族存在于St和Y亚基因组不足以证明Y直接起源于St。E10在所选二倍体代表中丰度较低而在E. tsukushiensis较高，主要FISH阵列仅见于五对Y染色体；既往qPCR显示E10拷贝数与含H基因组组合统计关联，而FISH定位主要阵列于Y，说明定量与物理定位信息不同，强调联合方法重要性；E10与Thinopyrum中P523相关序列相似及其Y定位可能反映Y与V/Jv相关谱系保留相关重复序列，但卫星DNA高演化动态及同源重复独立扩增或减少可能限制以单一重复分布作为系统发育独立证据；E10可视为所研究accession的潜在Y相关细胞遗传学标记，但不能作为所有Y染色体通用标记，因可检测阵列仅见于七对Y染色体中的五对。H相关重复呈至少三种分化方式：E12偏好H大阵列且总体丰度较高，E16在极低拷贝数下仍维持主要H的有限有序位点，E15在广泛多亚基因组分布背景上H信号相对增强；E12和E16应视为优先H相关重复而非严格H特异标记。E13分布最广，所有H、St、Y染色体间质区均有分散信号且定量变异中等，提示较高度保守；E11和E6虽广泛分布，但既往分别对Dasypyrum villosum小麦背景4VL及小麦–D. villosum渐渗系V染色体具标记价值，说明广泛分布不排除细胞遗传学信息性；诊断价值不限于基因组特异性，还取决于特征性局部积累和特定细胞遗传学背景中的可重复性。应用上，经更多accession和基因组背景验证后，具明显亚基因组关联的重复可与现有FISH探针组合用于鉴定种间杂种和渐渗材料中St、H、Y来源染色质；E9和E10分别作为St和Y相关染色质标记候选，E12和E16可补充H相关染色体区域鉴定探针，但需确认遗传多样材料中的模式稳定性和特异性。总体而言，E. tsukushiensis重复景观兼具广泛保留和快速分化组分；同源重复家族可跨相关基因组谱系持续存在，但其丰度和染色体组织可在物种、亚基因组和染色体水平显著分化；其他小麦族研究中的类似模式支持马赛克式、家族特异性重复DNA演化模型而非统一全基因组响应。当前分析基于单一E. tsukushiensis accession，所观察模式应主要视为所研究基因型特征，需更广泛比较采样区分祖先重复模式与异源多倍化后变化。

研究结论翻译：本研究结果支持如下假设：在E. tsukushiensis异源多倍体基因组中，卫星重复丰度与染色体组织是相关但不等价的重复DNA组织特征。FISH定位表明，所研究E1–E16家族在St、H和Y亚基因组间染色体组织差异显著，其分布涵盖从单亚基因组大阵列局部积累到两亚基因组和多亚基因组广泛分散的广谱模式；E7和E9的大FISH可检测阵列与St亚基因组关联尤其明显，E10与Y亚基因组关联，E12和E16与H亚基因组关联。将FISH模式与既往qPCR数据比较表明，重复家族的数量丰度和其染色体物理组织是互补但不等同的特征；高拷贝数可与有限染色体上的局部积累共存，如E9；低总体丰度不排除形成可重复的细胞遗传学可区分位点，如E16；E10进一步说明，重复拷贝数与特定基因组组分的统计关联，若无细胞遗传学验证，不应直接解释为其在该亚基因组中的物理定位。因此，qPCR与FISH数据比较支持全基因组数量丰度不一定预测重复家族主要染色体阵列亚基因组定位的假设。在所研究重复中，E9、E10、E12和E16显示作为亚基因组相关细胞遗传学标记进一步评估的潜力；经多样遗传背景验证后，此类标记可用于种间杂种和渐渗材料中St、H、Y来源染色质的细胞遗传学鉴定与监测。在所研究accession中，E9主要可检测阵列限于St亚基因组，E10限于Y亚基因组，E12和E16优先与H亚基因组关联；但由于本研究仅分析单一E. tsukushiensis accession，这些模式目前应主要视为所研究基因型的特征而非固定物种级特征，其种内稳定性、遗传性和更广泛诊断适用性需以生物学独立且具代表性采样验证，包括更多植株和accession及必要时不同群体或地理来源材料，遗传性评估还需分析后代和/或减数分裂传递。更广泛而言，联合解释定量与细胞遗传学数据可提供重复丰度和染色体组织的互补信息，从而更完整表征多倍体小麦族重复DNA的亚基因组分化；需进一步比较近缘二倍体和多倍体小麦族物种，以判断所观察亚基因组差异是 inherited from ancestral genomic lineages 还是 allopolyploidization 后演化产生。