《Toxins》：Effects of Zearalenone on Autophagy in the Testes of Male Mice at Different Developmental Stages
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玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA）是一种雌激素性真菌毒素，对雄性生殖健康构成潜在威胁。本研究探讨了ZEA的年龄依赖性睾丸毒性及其与自噬相关变化的关系。研究人员采用不同发育阶段的雄性C57BL/6J小鼠、TM3细胞和原代绵羊Leydig细胞，评估ZE
玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA）是一种雌激素性真菌毒素，对雄性生殖健康构成潜在威胁。本研究探讨了ZEA的年龄依赖性睾丸毒性及其与自噬相关变化的关系。研究人员采用不同发育阶段的雄性C57BL/6J小鼠、TM3细胞和原代绵羊Leydig细胞，评估ZEA对睾丸形态、睾酮分泌、自噬相关蛋白表达及信号通路的影响。ZEA诱导4–8周龄小鼠曲细精管结构紊乱和生精细胞脱落，而2周龄小鼠未见明显的睾丸病理变化。ZEA暴露后血清睾酮水平呈下降趋势，但差异无统计学意义。Western blotting结果显示，睾丸组织中自噬相关蛋白表达发生变化，包括Beclin1和LC3水平降低，同时2、6和8周龄时PI3K和AKT磷酸化升高，6和8周龄时mTOR磷酸化显著升高。体外实验中，40 μM ZEA显著降低TM3和原代绵羊Leydig细胞的活力，并改变自噬相关蛋白的表达。这些变化伴随PI3K和AKT磷酸化升高，而两种细胞模型中mTOR磷酸化升高均无统计学意义。综上，这些发现表明，小鼠对ZEA相关睾丸毒性的易感性随发育阶段而异，4–8周龄小鼠出现更明显的组织病理学改变。ZEA暴露还与自噬相关蛋白表达改变及PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化相关。仍需进一步研究确定ZEA是否改变自噬通量，以及这些信号变化是否在睾丸毒性和Leydig细胞功能障碍中发挥因果作用。
玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）是镰刀菌属真菌产生的非甾体雌激素样霉菌毒素，广泛存在于谷物和动物饲料中，可经食物链进入机体，对雄性生殖健康构成潜在威胁。自噬（autophagy）是真核生物中高度保守的降解机制，在精子发生过程中负责降解和循环利用多余蛋白质或受损细胞器，维持细胞稳态。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/AKT/mTOR）信号级联是抑制自噬活性的主要调控轴，在睾丸实质中高表达，可调控精子发生进程和Leydig细胞功能。已有研究显示，出生后雄性小鼠睾丸自噬水平呈现从1–2周龄升高、2–8周龄下降的发育规律，且与PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化呈显著负相关。ZEA可干扰Leydig细胞功能，但其通过自噬相关信号通路影响睾丸Leydig细胞的具体机制尚不充分明确。为此，研究人员探索了不同发育阶段雄性小鼠对ZEA睾丸毒性的易感性差异，并重点考察PI3K/AKT/mTOR通路和自噬相关蛋白的变化。
研究人员以SPF级雄性C57BL/6J小鼠（购自中国农业科学院兰州兽医研究所）为对象，设置2、4、6、8周龄四个年龄组，每组12只，按随机原则分为对照组和ZEA组（n=6）。通过腹腔注射20 mg/kg ZEA连续3天建立短期高剂量危害识别模型。体外实验使用小鼠睾丸Leydig细胞系TM3（购自北纳创联生物技术有限公司）和原代绵羊Leydig细胞，采用CCK-8法检测细胞活力，并以40 μM ZEA处理24小时。通过ELISA检测血清睾酮，H&E染色观察睾丸组织形态，Western blotting检测自噬标志蛋白（p62、Beclin1、LC3）及PI3K/AKT/mTOR通路总蛋白和磷酸化蛋白水平。数据分析采用t检验、单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验。
2.1 体重、睾丸重量及相对睾丸重量：通过称重分析，与对照组相比，ZEA组4周龄（p < 0.001）和6周龄（p < 0.05）体重显著增加，2周和8周龄无显著差异；各年龄组睾丸重量和相对睾丸重量均无显著差异，表明ZEA存在年龄依赖性整体生长影响，但未显著改变睾丸组织质量。
2.2 血清睾酮测定：采用ELISA检测，ZEA组各周龄血清睾酮均值均低于对照组，但差异均无统计学意义，尚不能确立ZEA显著降低循环睾酮水平。
2.3 组织学观察：H&E染色显示，2周龄ZEA组小鼠曲细精管结构较完整；4、6、8周龄小鼠出现生精细胞脱落、排列紊乱等明显病理改变，且随周龄增加损伤更显著，表明ZEA诱导的睾丸损伤具有年龄依赖性。
2.4 自噬标志蛋白表达：Western blotting检测显示，与对照组相比，ZEA组p62蛋白在2、4、8周龄极显著降低（p < 0.001）；Beclin1在2周龄显著降低（p < 0.01）、4周龄降低（p < 0.05）、6和8周龄极显著降低（p < 0.001）；LC3II/LC3I比值在4、6、8周龄极显著降低（p < 0.001）。提示ZEA暴露与睾丸组织自噬相关蛋白表达下调相关。
2.5 自噬通路：Western blotting检测磷酸化水平显示，ZEA组2和6周龄PI3K磷酸化极显著升高（p < 0.001）、8周龄显著升高（p < 0.01）；AKT磷酸化水平变化趋势与PI3K一致；mTOR磷酸化在6和8周龄极显著升高（p < 0.001）。表明PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化增强与自噬相关蛋白变化伴随出现，但因果关系未确立。
2.6 ZEA对Leydig细胞活力的影响：CCK-8法结果显示，ZEA呈浓度依赖性地降低原代绵羊Leydig细胞和TM3细胞活力；40 μM ZEA在两种细胞中均引起极显著的活力下降（p < 0.001），故后续实验选用该浓度。
2.7 ZEA对绵羊Leydig细胞自噬的影响：Western blotting显示，40 μM ZEA处理后，Beclin1表达极显著降低（p < 0.01），LC3表达显著降低（p < 0.05）；PI3K磷酸化升高，AKT磷酸化显著升高（p < 0.05），mTOR磷酸化升高但无统计学意义。
2.8 ZEA对小鼠睾丸Leydig细胞自噬的影响：Western blotting显示，40 μM ZEA处理后，Beclin1表达降低（p < 0.05），LC3表达显著降低（p < 0.01）；PI3K磷酸化升高（p < 0.05），AKT磷酸化显著升高（p < 0.01），mTOR磷酸化呈升高趋势但差异无统计学意义。
讨论部分总结了ZEA暴露与自噬相关蛋白表达和PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化变化的关联，指出这些变化与年龄相关的睾丸组织病理学改变同时出现，但研究未直接测定自噬通量，不能确立通路磷酸化与自噬抑制之间的因果作用。研究人员提出，2周龄小鼠睾丸基础自噬水平较高，可能有助于抵抗ZEA诱导的自噬相关变化，但该假设需进一步验证。体外绵羊Leydig细胞和TM3细胞结果与体内一致，增强了结论的跨物种可靠性。研究局限性在于20 mg/kg剂量为短期高剂量危害识别模型，未定量检测血清和睾丸组织中的ZEA及其代谢物，未来需开展定量毒代动力学分析和更贴近膳食暴露的场景研究。
结论：ZEA诱导的睾丸损伤具有年龄依赖性特征，4–8周龄小鼠出现更明显的组织病理学改变，表现为曲细精管结构破坏和生精细胞脱落。体内和体外实验均显示自噬相关蛋白表达改变，并伴有PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化变化。然而，自噬通量未被直接评估，该信号通路在所观察变化中的因果作用尚待确定。ZEA处理小鼠血清睾酮水平呈下降趋势，但差异无统计学意义。综上，这些发现为进一步研究ZEA诱导雄性生殖毒性的分子机制提供了基础。
