《Toxins》：Establishing a Rapid Monitoring Method for Mycotoxin Contamination in Cattle Herds—Urinary Measurement with Commercially Available Lateral Flow Immunochromatographic Strip Test
编辑推荐：
玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）是一种影响奶牛繁殖的雌激素性霉菌毒素；脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON）具有细胞毒性和免疫毒性，并可降低蛋白质合成。ZEN和DON污染会降低繁殖母牛的生产力。研究人员评估了商品化侧流免疫
玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）是一种影响奶牛繁殖的雌激素性霉菌毒素；脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON）具有细胞毒性和免疫毒性，并可降低蛋白质合成。ZEN和DON污染会降低繁殖母牛的生产力。研究人员评估了商品化侧流免疫层析试纸条（lateral flow immunochromatographic strip tests, LFISTs）作为牛尿液ZEN和DON暴露快速一线筛查方法的可行性。研究人员利用来自13个日本黑牛（Japanese Black, JB）和14个荷斯坦弗里斯牛（Holstein Friesian, HF）牛群的81份样本，通过分析感兴趣区域（regions of interest, ROIs）内测试线和控制线照片，对线强度比进行定量。LFIST与酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）显著相关（ZEN/Cre：p < 0.001且τ = 0.35；DON/Cre：p < 0.001且τ = 0.31），并与液相色谱-串联质谱（liquid chromatography–tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）显著相关（ZEN/Cre：p = 0.002且r = 0.35；α-玉米赤霉烯醇（α-zearalenol, α-ZOL）/Cre：p = 0.013且r = 0.27；β-玉米赤霉烯醇（β-zearalenol, β-ZOL）/Cre：p = 0.007且r = 0.30；ΣZEN/Cre：p = 0.005且r = 0.31）。研究人员采用Weibull加速失效时间模型（Weibull accelerated failure time model）分析探讨参数间关系。LFIST-ZEN和LFIST-DON分别与ELISA ZEN/Cre（p = 0.00057）和ELISA DON/Cre（p = 0.00061）显著相关。为检验LFIST能否预测饲料中霉菌毒素污染，研究人员分析了另外9个已知饲料霉菌毒素水平的牛群（n = 38）数据。估计方程将饲料ZEN和DON浓度与牛群尿液ZEN和DON水平相关联。研究结果支持LFIST作为ZEN和DON暴露牛群水平快速一线筛查工具的潜在效用，可在检测开始后约15 min内获得LFIST结果的筛查信息；当怀疑暴露时，仍需要进行确证性实验室分析。
研究背景与问题：霉菌毒素污染是牛群管理中的重要危害点。ZEN和DON等镰刀菌霉菌毒素在全球饲料中广泛存在且常共污染；全球变暖与气候变化可能增加暴露风险。饲料污染不仅影响牛群繁殖力、生产力和农场经营，也关系畜产品安全。饲料中真菌生长和产毒受季节、地区、干旱、收获、加工、储存和流通等多因素影响，因此需要对各牛群饲料污染水平和状态进行亚临床监测。现有HPLC、HPLC-MS/MS等准确性高但复杂、昂贵、耗时，不适合现场大样本筛查；ELISA样品前处理繁琐耗时；免疫荧光法需特殊设备且依赖实验室。LFIST具有无需实验室、灵敏度高、特异性高、成本低、适合现场等优点，且金纳米颗粒（gold nanoparticles, AuNPs）是常用标记材料。商品化LFIST主要用于饲料或食品基质快速筛查，但其用于牛尿这一生物基质进行牛群水平霉菌毒素暴露监测的适用性尚未充分评估。因此，本研究目的不是开发LFIST技术本身，而是评估商品化LFIST用于牛尿ZEN和DON暴露快速一线筛查的可行性，并分析其读数与已建立ELISA和LC-MS/MS尿液检测之间的关系；LFIST被定位为提示是否需要进一步实验室检查的筛查工具，而非确定性诊断或定量替代方法。
关键技术与方法：样本来自日本正在监测的牛群：实验1包括81份尿样，来自13个JB和14个HF牛群，每群3头；实验2使用另外9个牛群（n = 38）已知饲料霉菌毒素水平的数据，配对饲料—尿液样本中ZEN为32对、DON为10对。尿样冻存后解冻、混匀并离心；采用商品化ZEN和DON LFIST，未稀释上清200 μL与结合物微孔混合，室温孵育4 min，插入试纸条显色5 min，1 min内记录；300 DPI扫描后以FIJI/ImageJ在感兴趣区域（regions of interest, ROI）提取灰度，计算测试线/控制线强度比。结果与ELISA（肌酐校正）及LC-MS/MS（ZEN、α-ZOL、β-ZOL、ΣZEN）比较；统计分析使用R 4.5.2，包括Pearson r、Kendall τ、Spearman ρ、参数左删失回归（加速失效时间[accelerated failure time, AFT]形式）和线性回归。
研究结果：
2.1 日本黑牛与荷斯坦弗里斯牛尿液霉菌毒素污染水平：通过LFIST、ELISA和LC-MS/MS比较JB与HF牛群尿液霉菌毒素水平，HF牛群在三种方法中均持续较高；多数比较p < 0.001，LFIST ZEN与ELISA ZEN/Cre为p < 0.01。结论为HF牛群尿液霉菌毒素污染水平较高。
2.2 实验1：LFIST与实验室检测方法：通过将LFIST读数与LC-MS/MS和ELISA尿液测量进行相关分析，LFIST ZEN与ΣZEN/Cre显著相关（p = 0.005，r = 0.31）；LFIST DON与ΣZEN/Cre显著相关（p < 0.001，r = 0.49）；LFIST ZEN与LFIST DON显著相关（p < 0.05），提示ZEN污染较高时倾向于与DON水平较高共现。LFIST与ELISA分析显示，LFIST ZEN与ZEN/Cre显著相关（p < 0.001，τ = 0.345），LFIST DON与DON/Cre显著相关（p < 0.001，τ = 0.307）；交叉关联中LFIST ZEN与DON/Cre显著（p < 0.001，τ = 0.245），LFIST DON与ZEN/Cre显著（p < 0.001，τ = 0.342）。为处理低于检测/定量限的ELISA数据，采用参数左删失回归（AFT形式），LFIST ZEN预测ELISA ZEN/Cre和LFIST DON预测ELISA DON/Cre均显著（p = 0.00057和p = 0.00061），并给出估计式：UrinaryZEN/Cre ≈ 11.35 × exp(0.036 × LFISTZEN)；UrinaryDON/Cre ≈ 1.65 × exp(0.018 × LFISTDON)。按品种分层，HF牛中LFIST ZEN与ZEN/Cre（p = 0.018）、LFIST DON与DON/Cre（p = 0.0055）仍显著；JB牛中相应关联不显著（p > 0.05）。结论为LFIST读数与实验室尿液ZEN和DON测量存在统计学显著但中低度关联，且在本研究条件下HF中更易检测到该关系。
2.3 实验2：饲料与尿液霉菌毒素污染：通过配对饲料—尿液样本分析，ZEN为32对、DON为10对。饲料ZEN与尿液ZEN显著相关（p < 0.001）；DON相应关联不显著（p > 0.05），但DON配对观察有限，该结果应视为初步和假设生成，不能解释为无关系。以饲料污染水平预测尿液污染水平时，ZEN采用参数左删失回归（AFT形式），DON采用标准线性回归，得到：UrinaryZEN/Cre ≈ 4302.19 × exp(0.0004 × FeedZEN)；UrinaryDON/Cre ≈ 275.18 + 0.012 × FeedDON。进一步给出由尿液LFIST读数估计饲料污染水平的公式，其中LFISTZEN ≈ 164.36 + 0.011 × FeedZEN；LFISTDON公式在原文中显示为LFISTDON ≈ 55.56 × ln。结论为饲料ZEN与尿液ZEN显著相关，DON评价受样本量限制，LFIST结合尿液检测有望用于牛群霉菌毒素暴露的现场快速筛查和饲料污染间接估计。
讨论部分总结：
3.1 实验1：LFIST与ELISA和LC-MS/MS测量显著相关，但相关强度为中低度；方法间存在分析差异，包括LFIST和ELISA依赖抗体特异性及潜在交叉反应，LC-MS/MS为化合物特异性检测；样品前处理不同，LFIST未进行固相萃取或酶水解，而ELISA和LC-MS/MS尿液经β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶处理和固相萃取；尿基质如比重、离子组成、pH等可能影响毛细流动、抗原—抗体反应和信号强度，但未独立评估。因此LFIST不应被视为ELISA或LC-MS/MS的分析等效或定量替代，而应作为牛群水平快速一线筛查。本研究中控制带强度受尿样浓度影响，测试带/控制带比值法被认为是合理方法。HF与JB差异不应解释为品种固有代谢或易感性差异，品种与生产系统、采食量、日粮组成和管理实践混杂，品种分层结果应视为探索性。LFIST ZEN与LFIST DON显著关联符合两种镰刀菌毒素常共污染，但不能据一种毒素检测推断另一种毒素的存在或浓度。预测方程应视为探索性，需外部验证。
3.2 实验2：饲料ZEN与尿液ZEN显著相关，DON因配对样本少（n = 10）而受限，DON模型应视为初步并需外部验证。研究建立饲料霉菌毒素浓度与尿液霉菌毒素浓度之间的估计方程，并基于日本饲养标准，以JB 5 kg、HF 20 kg粗饲料为参考值建立估计方程。饲料中霉菌毒素分布不均匀，可能影响饲料监测准确性；尿液霉菌毒素浓度可反映实际经口摄入，因此尿监测具有现场实用性。研究提出筛查—确证—管理（screen–confirm–manage）三步框架：先用LFIST对代表性牛只尿液进行快速初筛；若提示可能暴露，则用第二份尿样及更多牛只重复，并以ELISA和必要时LC-MS/MS进行定量确证；确证污染后调查可疑饲料来源、储存和湿度条件、饲料原料和供应商，并在兽医或营养师咨询下考虑饲料更换等措施，干预后复测尿液和/或饲料。研究还指出需要独立数据集外部验证预测方程，建立前瞻性操作筛查阈值并评估灵敏度与特异度。局限包括：尿样为冻存后离心样品，未验证新鲜未离心尿的LFIST性能；尿基质效应未系统评估；LFIST重复性、再现性及抗体与尿液代谢物交叉反应需评估；DON配对小样本限制统计效能和推广性；品种未与生产系统等实验隔离；预测方程需更大更平衡牛群外部验证。
研究结论翻译：饲料霉菌毒素污染仍然是牛群管理中的重要问题。本研究对商品化LFIST用于牛群水平尿液ZEN和DON暴露快速一线筛查进行了可行性评估。LFIST读数与采用已建立实验室方法获得的尿液ZEN和DON测量值显著相关，尽管这些关联强度为中等至中等偏弱。在配对饲料—尿液分析中，饲料ZEN浓度也与尿液ZEN测量值显著相关，而DON评价受配对观察数量少的限制。这些发现证明了统计学关联，但未证明LFIST、ELISA和LC-MS/MS之间的分析等效性或可互换性。因此，目前不应将LFIST视为已建立实验室方法的定量替代方法。相反，它可能具有作为筛查—确证—管理框架中初始筛查步骤的潜力，即对提示可能存在霉菌毒素暴露的结果进行确证性实验室分析，并在支持污染时调查和管理可疑饲料来源。本研究建立的预测方程应视为探索性，在定量应用前需要独立外部验证。在常规现场实施前，还需进一步验证，包括样品处理要求、分析重复性和再现性、尿液基质效应及操作筛查阈值。
