从毒力因子到宿主互作：杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）致病机制与防控研究进展

《Toxins》：Study Progress on Pseudomonas plecoglossicida—Virulence Factors, Prevention and Control Methods, and Interaction with Host

　　

杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）是水产养殖中的革兰阴性（Gram-negative）机会性病原体，可感染大黄鱼（Larimichthys crocea）、斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）和黄姑鱼（Nibea albiflora）等多种具有重要经济价值的鱼类。由于其高发病率和死亡率，由该菌引起的内脏白点病（VWND）已成为威胁水产养殖可持续发展的主要细菌性疾病，并在全球范围内造成巨大经济损失。得益于双RNA测序（dual RNA-seq）等技术的巨大进步，目前对杀香鱼假单胞菌致病性及相关宿主防御机制的认识已显著加深。然而，该菌许多与致病性相关的机制仍未被揭示，包括多种未注释细菌毒力因子的功能。因此，亟需发展新的理论和实践方法以应对杀香鱼假单胞菌带来的挑战。本综述总结了该微生物病原体在毒力因子、防控策略及宿主-病原互作方面的研究进展。本综述有助于更全面地理解杀香鱼假单胞菌的致病机制，并为其防控提供新的见解和策略。

论文主体部分可概括为以下内容。

**1 引言**
杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）为具极生鞭毛的革兰阴性（Gram-negative）杆状菌，最早自日本淡水养殖香鱼细菌性出血性腹水病中分离，现已在虹鳟、银汉鱼、大黄鱼、斜带石斑鱼和黄姑鱼等多种养殖鱼中检出。其表型及生化特征与Pseudomonas putida相似，可通过管家基因或全基因组序列区分。基于适配体和表面增强拉曼散射（SERS）的检测方法为快速检测奠定基础，但成本与操作要求限制其应用。该菌感染多见于水温低于20℃的冬春季，典型症状为脾、肾和肝形成白色肉芽肿，即内脏白点病（VWSD/VWND），在大黄鱼中尤为常见；感染早期症状不明显，数日后死亡率逐渐升高。目前尚无商业化疫苗，早期检测和致病机制研究仍处初期，亟需筛选毒力靶点并发展新型防控策略。

**2 毒力因子及毒力调控系统**
病原菌感染包括黏附、侵入、体内/胞内生存、免疫逃逸、体内增殖、产毒和致病等阶段。鞭毛、外膜蛋白（OMPs）、菌毛、分泌系统（SS）和金属转运系统等参与定植、黏附、运动、营养获取和耐药；双组分系统（TCSs）和胞外功能（ECF）σ因子等调控系统参与毒力及耐药调节。该菌毒力因子研究仍有限，具体致病机制尚不清楚。

**2.1 鞭毛**
鞭毛由丝状体、钩和基体组成，由基体马达驱动旋转，除运动外还介导黏附、定植和生物被膜形成，并可充当大分子蛋白转运装置。敲除或敲低该菌鞭毛基因后，运动、黏附、生物被膜形成及对宿主毒力均显著降低；鞭毛蛋白具免疫学特性，可能作为检测和免疫靶点。

**2.2 外膜蛋白**
OMPs是革兰阴性菌外膜特有成分，约占外膜总组成50%，参与维持结构、感知环境并调控通透性，并与鞭毛、脂多糖（LPS）、荚膜多糖和菌毛共同构成表面抗原，参与黏附、侵入、破坏宿主细胞和免疫逃逸。敲低ABC转运蛋白（ATP binding cassette transporters）基因可改变宿主转录组，涉及趋化因子信号、凝血与补体系统及造血细胞谱系等通路。OMPs免疫原性强，该菌重组外膜孔蛋白F（rOprF）可诱导强免疫应答并保护大黄鱼，具候选疫苗潜力。

**2.3 分泌系统**
革兰阴性菌具有双层膜和周质空间，进化出多种蛋白分泌系统，已发现T1SS~T7SS和T9SS，参与毒力、异源蛋白分泌和疫苗开发。该菌研究主要集中于T6SS和T3SS。预测的T3SS效应蛋白PP_ExoU参与Hela细胞质膜损伤；敲除T3SS转位蛋白popB和popD影响鞭毛形态和组装，提示T3SS与鞭毛存在交叉对话。该菌已鉴定T6SS-1、T6SS-2和T6SS-3三个簇，T6SS突变株对大黄鱼毒力显著下降；T6SS具核酸酶活性，Txe1是介导种间杀灭大肠杆菌的主要T6SS毒素。分泌系统可作为减毒活疫苗靶点。

**2.4 生物被膜**
生物被膜（BF）是细菌黏附固体表面形成的微生物群落，由蛋白质、多糖、DNA和RNA等胞外聚合物（EPS）填充；多数细菌以BF形式存在，可增强存活、抵抗抗生素、环境应激和宿主免疫。敲低该菌cspA1后BF形成能力显著降低，cspA1突变株免疫斜带石斑鱼后相对存活值显著提高并产生有效持久免疫应答。BF形成还受pH、温度、盐度和金属离子浓度等外部因素影响；通过涂层、抗生素联用及新型抑制剂等策略可抑制BF。研究BF形成及调控机制有助于筛选抑制靶点并为减毒活疫苗提供策略。

**2.5 金属转运系统**
金属离子参与细菌生长代谢、呼吸和基因调控，过量有毒、缺乏限制生长，因此金属离子生物利用度和转运调控对维持稳态重要。宿主可通过分泌金属结合蛋白限制关键金属离子以抵抗感染，细菌则进化出复杂金属摄取和输出系统以生存和致病。该菌铁摄取系统研究较多；铁是细菌生长繁殖必需微量元素，也是宿主-病原竞争资源，形成铁“拉锯战”。病原体可分泌铁载体（siderophore）螯合铁，并经特定外膜受体转运铁-铁载体复合物。pyoverdine（PVD）作为该菌重要铁载体，影响铁获取、BF形成和宿主器官内细菌分布；脾脏铁蛋白丢失可能是石斑鱼感染后死亡的主要原因。革兰阴性菌在铁胁迫下可产生转铁蛋白结合蛋白或乳铁蛋白结合蛋白，直接结合宿主转铁蛋白或乳铁蛋白，过程由TonB系统（TonB-ExbB-ExbD）供能。敲低tonB后该菌运动和BF形成能力显著受损，tonB-RNAi株感染斜带石斑鱼后的存活率较野生株提高20%；敲除TonB依赖性受体家族成员fusA显著影响生长和黏附等生理过程。靶向铁载体抗毒力策略有望成为治疗选择并缓解抗生素耐药。

**2.6 铁摄取调节因子**
金属转运系统帮助细菌竞争必需金属离子，但金属过量会损害细菌，因此金属转运调控对原核生物金属稳态关键。Fur（ferric uptake regulator）和Zur（zinc uptake regulator）是较常见转录调控因子。EMSA等实验发现Fur感知该菌铁浓度变化并调控ZnuCBA锌摄取系统。尽管Fur影响细菌毒力的假说已有较多研究，但在该菌中很少被鉴定；进一步研究Fur在内脏白点病病理生理中的基础功能有助于开发治疗药物。

**2.7 双组分调控系统**
TCSs是细菌广泛分布的信号转导和通讯系统，经典TCS由膜嵌入组氨酸激酶（HK）和应答调节蛋白（RR）组成；HK感知外界刺激，通过磷酸化和去磷酸化调控RR，活化RR结合特定基因启动子调节表达，使细菌适应环境。许多细菌携带多个TCS，TCS对生长、繁殖、代谢和毒力至关重要。该菌GacS/GacA双组分系统主要参与鞭毛组装、代谢、细菌趋化和BF形成；新发现的PvgAS通过调控T6SS和T3SS对该菌胞内生存和宿主组织定植至关重要。深入研究TCS类型、结构和生物学功能可能发现防控靶点。

**2.8 ECF σ因子介导的温度感应**
温度相关细菌致病过程受关注，但确切调控机制尚待阐明。该菌引起的大黄鱼内脏白点病呈明显温度依赖性，仅在16–20℃发生，温度超过20℃后疾病逐渐消退。ECF σ因子是细菌信号转导第三支柱，接收外部刺激并调控适应性行为。SigX作为ECF σ因子参与铁摄取、BF形成和运动；研究发现SigX在温度诱导毒力中显著诱导，并可调控斜带石斑鱼免疫网络相关通路，是温度相关不可或缺的毒力因子。冷休克蛋白CspA1通过调控SigX表达以温度特异性方式促进毒力；热休克蛋白（HSPs）家族成员HtpG表达与温度刺激密切相关并影响毒力和宿主免疫应答强度。RpoE是革兰阴性菌重要且高度保守的ECF σ因子，以RpoE为核心的调控性膜内蛋白水解（RIP）信号通路介导跨膜信号转导和温度感应；敲低RpoE后BF形成和黏附能力显著改变，对石斑鱼毒力明显降低；RpoE还通过热感应调控T6SS、侵袭和种间竞争，对体外和体内生态位适应至关重要。以RpoE为中心的RIP级联通过热感应调控温度适应相关基因表达，有助于阐明致病机制并提供防控思路。

**3 亟需建立新的有效防控措施**
水产养殖发展迅速但受疾病制约，杀香鱼假单胞菌作为感染多种经济鱼类的重要病原受到关注。主要防控技术包括抗生素、疫苗和噬菌体疗法，群体淬灭可干扰细菌细胞间通讯并减弱毒力，也作为潜在替代策略。该菌多重耐药使传统抗生素疗效下降且副作用明显，因此疫苗、噬菌体疗法、抗菌肽（AMPs）和益生菌成为有前景的策略。

**3.1 抗生素耐药的出现难以避免**
目前经济鱼类治疗仍以抗生素为主，但细菌耐药和宿主免疫力下降等缺点不容低估。作为Pseudomonas成员，该菌可能通过修饰抗生素结合位点、改变细胞膜通透性、产生抗生素水解酶、形成BF和可移动遗传元件水平转移等机制产生天然和获得性耐药。过量使用环丙沙星（CIP）可破坏香鱼肠道稳态并降低后续感染存活率。对24株该菌基因组筛查发现6个耐药基因（ARGs），其中16株同时携带6个ARGs，仅8株同时缺失mexL；mexK、mexF、mexB、mexW和mexL编码耐药-结节-分裂（RND）超家族外排泵内膜转运蛋白，底物谱广，是革兰阴性菌临床相关外排转运蛋白；外排泵过表达可导致多重耐药（MDR）。cpxR编码细胞质应答调节蛋白，是CpxA/CpxR双组分系统重要组分，帮助细菌响应碱性pH、氧化、渗透和重金属应激，并可激活BF形成相关基因；CpxA/CpxR还可结合并激活mexAB-oprM操纵子等耐药基因启动子，促进多重耐药。上述6个ARGs均编码与多重外排泵复合物相关蛋白，部分解释该菌多重耐药机制。

**3.2 疫苗和佐剂研发亟需加速**
随着集约化养殖发展，细菌、病毒和真菌性疾病严重制约产业，开发适宜且经济的防控措施是重要课题。由于环保养殖意识增强和抗菌药物耐药（AMR）威胁，疫苗成为抗生素主要替代。水产疫苗按制备方法分为灭活疫苗、减毒活疫苗和基因工程疫苗，也有适用于中低收入国家的自体疫苗。该菌疫苗包括灭活疫苗、亚单位疫苗和减毒活疫苗仍处实验室阶段。灭活疫苗虽可提高血清抗体滴度但免疫保护较差；LQJ06灭活疫苗可增强斑马鱼免疫，注射免疫较口服诱导更高细胞免疫因子。亚单位疫苗安全性高；以P. putida主要表面抗原LPS、OMPs和EPS免疫鱼，虽诱导强烈体液和先天免疫，但相对存活率（RPS）仅0~40%；重组OprF（rOprF）可显著提高RPS至70.6%。植物如微藻作为口服亚单位疫苗系统具应用潜力。基于毒力基因理解，基因工程减毒活疫苗（LAVs）成为研究重点；T6SS-1关键毒力基因缺失的ΔtssD-1株腹腔注射大黄鱼后诱导较高特异性血清IgM和细胞免疫因子，实验室RPS达86.3%；沉默T6SS相关基因后毒力显著降低，clpV-RNAi株安全性最高，可作为LAV；铁摄取系统、鞭毛蛋白和转录因子也是LAV潜在靶点。佐剂本身无免疫原性但可非特异增强免疫应答、改变应答类型并减少抗原用量；polyactin（PA）、CpG-rich plasmid（pCpG）和铝佐剂（Al）优先诱导大黄鱼细胞免疫而非体液免疫，显著提高相对存活率；植物提取物如Pistacia atlantica提取物、昆布多糖（LAM）和人参茎叶皂苷（GSLSs）等佐剂复合物可不同程度增强疫苗效力。鱼类免疫系统和应答机制仍处基础研究，市售疫苗少，尚无有效该菌疫苗；多项水产疫苗在临床试验，佐剂系统在开发。

**3.3 噬菌体疗法是水产细菌病防控新思路**
噬菌体疗法利用噬菌体治疗细菌感染，噬菌体可靶向清除特定菌株而不伤害其他微生物。临床试验报道对葡萄球菌、假单胞菌、弧菌等有效。噬菌体具有制备简单、宿主特异性、不易诱导细菌耐药和强杀菌能力等优势，还可通过解聚酶等破坏BF。水产中噬菌体治疗较新；已分离嗜水气单胞菌、哈维弧菌和副溶血弧菌等特定噬菌体并研究治疗潜力。Park等分离PPpW-3和PPpW-4并制成噬菌体鸡尾酒应用于感染香鱼，保护率达78%；日本团队对两株裂解性噬菌体进行基因组序列分析并确认治疗潜力；抗生素与进化噬菌体联合策略较单用更有效。噬菌体治疗仍面临严格筛选标准：高裂解活性、明确宿主范围、基因组不携带水平转移细菌DNA片段风险、不编码毒素/毒力因子/耐药基因、不引起不良免疫应答；已有噬菌体鸡尾酒和基于CRISPR-Cas的体内基因编辑平台等策略，技术突破有望加速商业化。

**3.4 益生菌在水产养殖中日益受欢迎**
全球水产养殖快速发展，抗菌药物仍不可或缺，但滥用带来环境和健康问题，益生菌受关注。通常宿主来源益生菌比异源和环境来源更安全有效；作为饲料添加剂，益生菌无药物残留、不污染且促生长。水产益生菌主要有芽孢杆菌、乳杆菌、酵母菌、肠球菌、双歧杆菌和片球菌等，通过产生消化酶（如蛋白酶和淀粉酶）、竞争定植、调节宿主免疫和抑制病原菌发挥作用。例如，Leuconostoc mesenteroides提高鳟鱼抗杀鲑气单胞菌感染存活率，Pediococcus pentosaceus增强凡纳滨对虾饲料利用和消化酶活性；Liu等从大黄鱼肠道分离Lactiplantibacillus plantarum E2，可显著提高大黄鱼感染该菌后的存活率并改善肠道免疫环境。水产益生菌仍存在生物防治效果不稳定和物种多样性有限等挑战，限制广泛应用。

**3.5 抗菌肽“天然抗生素”**
抗菌肽（AMPs）是具广谱抗菌活性的蛋白，广泛存在于原核和真核生物，因独特作用机制和较低耐药倾向成为研发热点。饲料添加AMPs不仅增强水产动物免疫能力，还可显著改善水产品质量。黄姑鱼分泌的NK-lysin通过破坏细胞膜对哈维弧菌、杀香鱼假单胞菌等具广谱抗菌活性；基于大黄鱼干扰素-γ相关基因（IFNG1R）蛋白序列合成的SKL17-2对VWND有显著抑制作用，且可能不杀灭肠道益生菌，有望成为饲料添加剂。AMPs具广谱抗菌和低耐药风险，可替代或协同抗生素，减少用量和毒副作用并抑制耐药株出现，为缓解抗生素耐药提供新策略。

**4 宿主与杀香鱼假单胞菌的攻防互作**
宿主-病原互作涉及病原侵入、宿主防御反应及代谢免疫互作，是疾病发生基础。RNA测序和代谢组分析显示，该菌感染深刻影响宿主多条代谢和免疫相关通路。该菌毒力基因（包括SigX、SecY）可有效促进宿主防御系统表达，涉及补体和凝血级联、细胞因子-细胞因子受体互作、C型凝集素受体信号、NK细胞介导的细胞毒性和NOD样受体（NLR）信号等通路；宿主最显著变化还与糖酵解/糖异生及氨基酸和不饱和脂肪酸代谢相关，表明该菌参与宿主多种能源和营养利用。感染还影响宿主原生微生物群，引起大黄鱼肠道菌群显著失调，肠道细菌群落组成随疾病变化；益生菌Ligilactobacillus murinus S27通过改善肠道结构、上调抗菌肽基因、降低细菌载量和宿主死亡率缓解感染。传统转录组学难以分析病原和宿主细胞mRNA变化，高通量RNA测序灵敏度提高促成双RNA-seq；自Westermann等提出可同时分析病原和宿主基因表达变化以来，该技术已用于多个体外细胞感染模型实时监测互作转录组。双RNA-seq已用于水产动物与病原互作研究：以大黄鱼为模型鉴定免疫调控通路差异表达基因，揭示刺激隐核虫感染动态表达模式；对罗非鱼无乳链球菌感染脾脏研究显示NOD样信号通路关键作用；Huang等用双RNA-seq研究该菌感染大黄鱼和斜带石斑鱼，构建病原-宿主整合网络，预测并验证关键毒力基因，揭示宿主感染后免疫应答变化。随着生物技术应用，宿主与该菌互作调控机制将进一步阐明。

**5 未来展望**
该菌是Pseudomonas属较新鉴定物种，尽管几十年研究在致病机制、宿主防御和防控策略方面有进展，但认识仍有限，严重阻碍新型有效治疗药物开发。未来需解决多个关键问题：在全球抗菌药物耐药背景下，如何有效减缓水产养殖中耐药菌特别是该菌出现；还有哪些关键毒力因子未被发现，能否指导疫苗开发；细菌特别是该菌如何逃避鱼类免疫系统激活、吞噬和清除；如何克服水产病原抗生素替代品应用障碍，尤其注意该菌宿主特异性有限、抗生素替代品生产缺乏标准化行业指南和监管框架不成熟；如何通过选择育种增强鱼类抗该菌免疫。

**6 总结**
作为水产中常见革兰阴性条件致病菌，该菌严重扰乱全球水产养殖业健康发展。尽管多年探索在致病机制方面取得可观进展，但仍存在关键局限：单个毒力因子在感染不同阶段（黏附、侵入、胞内生存、免疫逃逸和产毒）中的确切机制仍未完全阐明，感染过程尚未系统评价；许多致病相关基因仍未注释，限制新毒力决定簇预测；纳米技术递送系统等新治疗途径在该菌中基本未探索。因此，从基础研究到实际防控应用仍有很长的路，未来应聚焦阐明致病性调控网络并将发现转化为有效靶向控制措施，支撑水产养殖可持续发展。