芒果内生镰刀菌的分离鉴定及其致病潜力研究

《Journal of Fungi》：Characterization and Pathogenic Potential of Endophytic Fusarium Species Isolated from Mango (Mangifera indica L.)

　　

摘要 本研究调查了从健康芒果果柄、茎和叶片中分离的内生镰刀菌（Fusarium）种类及其致病潜力。基于TEF1-α和RPB2基因的联合系统发育分析，共鉴定出三个种：Fusarium guangdongense、F. multiceps和F. hainanense。研究人员使用每个种的一个代表性菌株，在栽培芒果（Mangifera indica）和野生芒果（M. laurina）的离体果实上进行致病性测定，结果显示低至中等毒力，表现为有限的病斑扩展。F. hainanense和F. multiceps的测试菌株在M. indica和M. laurina的受伤及未受伤果实上均诱导了坏死性病斑。相比之下，F. guangdongense测试菌株在M. indica的受伤和未受伤果实上均诱导了病斑，但仅在M. laurina的受伤果实上诱导病斑。尽管采样覆盖了马来西亚五个州，但镰刀菌仅从两棵芒果树中分离获得，且每个种仅使用一个菌株进行致病性评价。因此，本研究结果为这些芒果相关内生镰刀菌在人工接种条件下的致病潜力提供了初步证据，但不应推广至其他菌株或自然发病情况。

芒果内生镰刀菌的分离鉴定及其致病潜力：研究解读

一、研究背景与目的

芒果（Mangifera indica L.）是全球重要的热带经济水果作物，因其独特风味、香气和高营养价值，全球消费需求持续增长。在马来西亚，2025年芒果种植面积约为4140公顷，总产量8746吨，约占21种主要水果作物总产量（2,014,784吨）的0.43%。然而，芒果的商业价值和出口潜力严重受到采后损失的制约，损失率因品种、国家和处理方式不同可达5%至45%。真菌性病害是导致采后损失的重要因素，据估计，真菌病原体每年造成收获水果和蔬菜约20%至25%的采后损失。在芒果中，炭疽病和茎端腐烂是影响采后果实品质的主要真菌病害，炭疽病可造成芒果生产30%至60%的经济损失。

传统上，炭疽菌属（Colletotrichum）和葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）被认为是芒果的主要采后病原体，但镰刀菌属（Fusarium）种类日益被认为是果实腐烂的重要致病因子。多种镰刀菌，包括F. oxysporum、F. proliferatum、F. solani、F. mangiferae以及Fusarium incarnatum-equiseti种复合群（FIESC）成员，已被报道可诱导芒果采后果实腐烂和茎端腐烂。然而，以往研究几乎完全集中于从有症状病斑中直接分离的菌株，对健康芒果组织（如果柄、茎和叶片）中无症状存在的内生镰刀菌种类的多样性和致病潜力了解甚少。许多采后病原体最初以内生菌形式存在于健康植物组织中而不引起明显症状，这种动态生活方式代表了内生菌-病原体连续体。果实成熟过程中宿主生理变化，包括宿主抗性下降和细胞壁降解，可能影响真菌定殖和病害发展。因此，本研究旨在利用形态学和分子方法分离并鉴定芒果相关内生镰刀菌种类，并在人工接种条件下评估其对受伤和未受伤离体芒果果实的致病潜力。

二、研究内容与主要结论

研究人员从马来西亚吉打州和玻璃市州的两棵芒果树（品种'Apple'和'Chok Anan'）的健康无症组织（花、果、叶、果柄、叶柄、茎和叶脉）中分离内生真菌，共获得99个内生真菌分离株，其中12个（12.1%）被鉴定为镰刀菌，分别来自果柄（n=6）、茎（n=3）和叶片（n=3）。基于形态学特征，这些镰刀菌被分为三个形态型。通过TEF1-α和RPB2基因的联合系统发育分析，形态型I被鉴定为F. guangdongense，形态型II为F. multiceps，形态型III为F. hainanense。

致病性测定使用每个种的一个代表性菌株（F. guangdongense M144、F. multiceps M206和F. hainanense M219），在栽培芒果'Golden Susu'（M. indica）和野生芒果（M. laurina）的受伤和未受伤离体果实上进行。结果显示，F. multiceps和F. hainanense在两种芒果的受伤和未受伤果实上均诱导了坏死性病斑，而F. guangdongense在M. indica的受伤和未受伤果实上均诱导病斑，但仅在M. laurina的受伤果实上诱导病斑。基于病害严重度指数（DSI），三个种在大多数处理中被归类为轻度毒力（DSI=25.00%），F. guangdongense在未受伤果实上表现为低毒力（M. indica上DSI=19.44%，M. laurina上DSI=5.56%）。对照果实均无症状。该研究首次提供了F. guangdongense和F. hainanense与芒果果实腐烂相关的初步证据，并表明F. multiceps可能作为植物病原体发挥作用。

三、关键技术与方法

研究人员采用表面消毒法从健康芒果组织中分离内生真菌，通过印迹法验证表面消毒效果。形态学鉴定基于在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）和石竹叶琼脂（CLA）上的宏观和微观特征。分子鉴定采用PCR扩增翻译延伸因子1-α（TEF1-α）和RNA聚合酶II第二大亚基（RPB2）部分序列，测序后在Fusarioid-ID数据库中进行BLAST比对，并利用MEGA12软件分别对Fusarium fujikuroi种复合群（FFSC）和FIESC进行基于TEF1-α和RPB2联合序列的最大似然（ML）系统发育分析。致病性测定在受伤（5mm长、2mm深切口）和未受伤的离体芒果果实上进行，接种7天后测量病斑直径并计算病害严重度指数。

四、研究结果

4.1 内生真菌的分离与形态学鉴定

从168块芒果组织中获得99个内生真菌分离株，其中12个为镰刀菌。根据菌落形态和分生孢子特征分为三个形态型：形态型I菌落绒状、浅紫色至粉红色，微分生孢子倒卵形至腊肠形（4.04–13.26 × 1.48–3.37 μm），大型分生孢子3个隔膜（14.09–20.82 × 1.62–3.30 μm）；形态型II菌落絮状、白色带黄褐色中心，微分生孢子纺锤形（7.02–13.92 × 1.39–2.23 μm），大型分生孢子3–5个隔膜（14.22–28.95 × 2.1–6.87 μm）；形态型III菌落棉絮状、灰白色，微分生孢子1–2个隔膜（7.63–12.62 × 1.62–2.59 μm），大型分生孢子3–5个隔膜（13.12–25.31 × 1.96–3.21 μm）。所有形态型均未观察到厚垣孢子。

4.2 分子鉴定与系统发育分析

TEF1-α和RPB2基因PCR扩增分别产生约600–700 bp和950–1100 bp的条带。BLAST比对显示，形态型I分离株（M144、M146、M204、M205）与F. guangdongense具有99–100%序列相似性；形态型II分离株（M206）与F. multiceps具有98–100%相似性；形态型III分离株（M218、M219）与F. hainanense具有99–100%相似性。联合ML系统发育分析将四个形态型I分离株置于F. guangdongense分支（94%自举支持），M206置于F. multiceps分支（100%自举支持），M218和M219置于F. hainanense分支（99%自举支持）。

4.3 致病性测定

在受伤的M. indica果实上，F. guangdongense M144产生的病斑长度（0.56 ± 0.11 cm）略小于F. hainanense M219（0.61 ± 0.13 cm）和F. multiceps M206（0.67 ± 0.13 cm），但三者间差异不显著，均表现为轻度毒力（DSI=25.00%）。在未受伤的M. indica果实上，F. guangdongense产生的病斑（0.27 ± 0.18 cm；DSI=19.44%）显著小于另外两种，被归类为低毒力；F. multiceps（0.56 ± 0.14 cm）和F. hainanense（0.46 ± 0.11 cm）均表现为轻度毒力。在受伤的M. laurina果实上，F. guangdongense产生的病斑（0.43 ± 0.11 cm）显著小于F. multiceps（0.71 ± 0.13 cm）和F. hainanense（0.73 ± 0.14 cm），三者均为轻度毒力。在未受伤的M. laurina果实上，F. guangdongense仅产生极小病斑（0.04 ± 0.09 cm；DSI=5.56%），与对照无显著差异，为低毒力；F. multiceps（0.65 ± 0.17 cm）和F. hainanense（0.61 ± 0.14 cm）均表现为轻度毒力。

五、讨论与结论

研究人员指出，仅依赖形态学特征进行镰刀菌鉴定存在局限性，因为不同物种间存在共有特征且种内存在显著表型变异，而TEF1-α和RPB2联合系统发育分析提供了更可靠的物种鉴定依据。F. guangdongense此前在中国柚类健康果实中被报道为内生菌，本研究首次初步证明其作为芒果内生菌具有诱导离体果实腐烂的潜力。F. hainanense最初从健康水稻茎中分离，已知可引起水稻鞘腐病、穗腐病和榴莲叶部病害，本研究首次证明芒果相关内生F. hainanense可在实验条件下诱导离体果实腐烂病斑。F. multiceps此前从海牛、红树林植物和沫蝉中分离，本研究首次报道其作为芒果内生菌并具有诱导果实腐烂的能力。

三个种的分离株在受伤和大多数未受伤果实上均能诱导病斑，表明这些镰刀菌是机会性病原体，可通过伤口侵入果实，部分菌株可能通过直接穿透或自然孔口侵入。F. guangdongense在未受伤M. laurina果实上不能诱导病斑，可能与宿主感病性差异或测试菌株的致病潜力有关。内生镰刀菌在果实成熟衰老过程中利用宿主基础抗性下降和细胞壁降解的生化转变，从内生状态转变为致病状态，这与芒果茎端腐烂的发展过程相似。果柄、茎和叶片中的内生镰刀菌可能作为采后腐烂的接种体来源。

研究结论：本研究成功从芒果果柄、茎和叶片中分离并鉴定了三种内生镰刀菌F. guangdongense、F. multiceps和F. hainanense。基于TEF1-α和RPB2联合序列的分子系统发育分析克服了形态学鉴定的局限性。致病性评估表明三个种的分离株在人工接种条件下对栽培芒果M. indica和野生芒果M. laurina均表现出致病潜力，但毒力为低至中等。本研究首次将F. guangdongense和F. hainanense与芒果果实腐烂联系起来，并提示F. multiceps可能作为植物病原体。这些内生真菌分离株能够感染受伤和大多数未受伤的芒果果实，突显了其机会主义特性和直接穿透果实的能力。在无症状果柄、茎和叶片中鉴定出这些病原体表明存在动态的内生菌-病原体连续体，内生镰刀菌可作为采后果实腐烂的接种体来源。因此，芒果果实腐烂的有效管理必须超越采后处理，纳入解决果园内内生接种体来源的采前策略。