塞尔维亚 Camelina sativa 霜霉病病原 Hyaloperonospora camelinae 的多基因系统发育、种子传播及流行病学特征研究

《Journal of Fungi》：Multilocus Phylogeny, Seed Transmission and Epidemiological Aspects of Hyaloperonospora camelinae Causing Downy Mildew on Camelina sativa in Serbia

　　

Camelina sativa 是一种日益重要的油料作物。本研究首次对塞尔维亚由 Hyaloperonospora camelinae 引起的亚麻荠霜霉病进行了全面表征。研究人员于2023年和2024年观察到叶片褪绿病斑、荚果变形，以及坏死叶中存在分生孢子（conidia）、分生孢子梗（conidiophores）和卵孢子（oospores）。两年中选取的分离物均显示典型 H. camelinae 形态，并在亚麻荠幼苗上确认了其致病性。基于内转录间隔区（ITS，internal transcribed spacer）、大核糖体亚基（LSU，large ribosomal subunit）和线粒体细胞色素c氧化酶亚基II（COX-2，mitochondrial cytochrome c oxidase subunit II）序列的分子鉴定和多基因系统发育分析，确认 H. camelinae 归属于 Hyaloperonospora，并确认了塞尔维亚分离物的鉴定。来自感染植株的种子发芽率为74.2%（对照为90%），对后代植株的传播率高达31.13%，证实了其流行病学重要性。研究记录了 H. camelinae 在亚麻荠组织内的不均匀分布，顶端植株部位无论症状和产孢是否可见，均具有最高检出率。茎部即使症状和产孢可见，也被证明不适合检测，表现为低检出率和低可靠性。田间条件下的病害动态提示了初侵染和两次次侵染的潜育期与产孢时间点，为综合病害管理项目中的病害监测提供了工具。

研究背景与目的：Camelina sativa（亚麻荠，false flax）为十字花科油料作物，因可作为生物燃料和饲料的可持续来源而重新受到关注；其原产欧洲和中亚，适应多种气候，种子含油量超过35%。尽管亚麻荠通常被认为较少受病害侵染，但已有猝倒病和根腐病、根肿病、链格孢黑斑病、黑胫病、白锈病、菌核病、白粉病及霜霉病（downy mildew）等报道；其中由 Peronospora spp.、Hyaloperonospora spp. 引起的霜霉病在冷湿地区具有重要经济意义。Hyaloperonospora 为 Peronosporaceae 第三大属，包含100余种，历史上归入 Peronospora，后依据分子系统发育并结合形态特征划分为 Peronospora sensu stricto、Perofascia 和 Hyaloperonospora。H. camelinae 为亚麻荠霜霉病病原，已在美国、波兰、奥地利、瑞士、西班牙、葡萄牙、保加利亚、德国和斯洛文尼亚报道，但许多流行病学问题仍需深入研究。塞尔维亚仅有一项简短记录，未进行病原表征、致病性确认或流行病学调查。因此，研究人员提出 H. camelinae 在塞尔维亚发生并显著影响亚麻荠生产的假设，旨在确认并形态鉴定病原、利用多基因序列确认其系统发育位置、研究种子传播、明确病原在植株内的分布及检测可靠性，并监测田间病害动态及初侵染和次侵染的可能时间点。

关键技术方法：研究人员于2023和2024年在塞尔维亚 Rimski ?an?evi（South Backa district）采集‘NS Zlatna’品种霜霉病症状植株，共30个随机样本（两年分别为19和11个），并以发病率低于1%田块中无症状隔离植株种子为对照。方法包括田间症状和发病率调查、人工接种致病性试验、孢子囊梗和孢子囊及卵孢子形态测量、CTAB法DNA提取、聚合酶链反应（PCR，polymerase chain reaction）扩增 ITS、LSU 和 COX-2 并测序、BLAST 比对、MEGA X 中最大似然法（Maximum Likelihood）多基因系统发育分析（1000次bootstrap）、H. camelinae 特异性引物 HC-L/HC-R 的PCR检测、1000粒种子10重复的种子传播试验、按植株组织部位采样并用二项广义线性模型（GLM，generalized linear model）比较检出频率，以及2024年每周田间采样和组检测最大似然估计病害比例。

研究结果：
3.1 Disease Symptoms in the Production Fields：两年田间症状相似，播后约4周（BBCH 10–14）出现叶片褪绿病斑，随后叶背和茎出现白色产孢，茎弯曲及荚果产孢；部分植株严重矮化并快速腐烂，田间呈不均匀斑块，中心约50%植株腐烂；开花期（BBCH 65）感染株比例为30%–40%（35.67 ± 4.08%），降雨和高湿后病情最高。
3.2 Pathogenicity：人工接种后4天出现褪绿斑，15天后部分植株矮化褪绿，叶背和茎下部有白色菌丝和产孢，对照无症状，确认 H. camelinae 的致病性及侵染幼苗能力。
3.3 Morphological Characteristics：30个分离物形态一致，孢子囊梗呈单轴至二歧分枝，孢子囊透明、卵形至椭圆形，大小为22–27 × 14–20 μm（均值23.15 ± 2.38 × 18.20 ± 2.43 μm；n = 30）；老坏死叶中卵孢子暗褐色，直径37.5–50.25 μm（均值45 ± 4.08 μm；n = 30）。
3.4 Molecular Identification and Phylogenetic Analysis：5个分离物扩增出ITS约700–1100 bp、LSU约1100 bp、COX-2约500 bp；BLAST显示与 H. camelinae 参考序列99%–100%一致；COX-2无可用 H. camelinae 序列，塞尔维亚序列为首次提交； concatenated 多基因比对含2691个核苷酸位点，其中813个简约信息位点；塞尔维亚分离物与 H. camelinae 参考序列聚类，bootstrap支持率100%，并与近缘种明显区分，确认鉴定。
3.5 Seed Transmission：病株种子种植后5–7叶期（BBCH 14–18，约播后5周）出现矮化和卷叶，可见白色产孢并经PCR确认；病株种子发芽率74.2%（742/1000），对照90%；742株萌发苗中511株健康、231株有症状，传播率31.13%；合并症状苗PCR阳性，健康苗和对照苗阴性。
3.6 Pathogen Distribution Within the Plant：对症状和无症状植株分组织采样并以HC-L/HC-R PCR检测，两次独立试验各5个重复；无症状植株仅在顶端组织（1/5和1/5）及上侧枝（1/5和0/5）检出，茎和基部茎未检出；症状植株所有亚样本均可检出但频率不同，顶端和有症状上侧枝均全部检出，无症状上侧枝为4/5和4/5，无症状中央侧枝为3/5和2/5；茎部检出低，中央茎和有症状/无症状基部茎多为1/5；统计显示症状植株与无症状植株间检出频率差异极显著（p < 0.001），症状植株内有症状与无症状组织间差异显著（p = 0.027），表明病原分布不均，顶端组织最适合检测，茎部不适合，无症状顶端可用于早期检测。
3.7 Field Epidemiology and Dynamics of Disease Incidence：2024年每周采样并以组检测最大似然估计病害比例；第1周无PCR阳性但田间可见症状，可能受随机采样和检测阈值影响；第2周少量阳性，提示种子传播苗；第3周无阳性，可能与随机采样、病苗快速倒伏及次侵染低于阈值有关；第4周出现5个阳性，可能与次侵染潜育期结束及降雨有利产孢有关；第6周出现峰值，原文提示与进一步次侵染相符；第7周25 L/m²大雨后更多植株降解，可能涉及病害和虫害，阳性样本减少；总体田间发病率估计为35%，病株矮化至10 cm并快速坏死腐烂。

讨论与结论：本研究首次在塞尔维亚对 H. camelinae 所致亚麻荠霜霉病进行分子、系统发育、流行病学和种子传播表征。症状与其他地区报道基本一致；高湿和中温期病情较重，但未进行正式气象相关分析。老坏死叶中卵孢子提示病原可在病残体越冬，并可能与感染种子共同构成初侵染源，强调轮作和清除病残体的必要性。分子分析确认塞尔维亚分离物身份；GenBank中 H. camelinae 序列仅7条且无COX-2序列，ITS和LSU的BLAST一致性为99%–100%，系统发育拓扑与已发表结果一致，支持结合致病性性状和分子分析区分近缘 Hyaloperonospora 种及寄主专化性。种子传播方面，前人曾在种子表面检出分生孢子和分生孢子梗，本研究传播率为31.13%，低于先前报道的96%，后者评估时期更晚并可能包含大量次扩散；原文还指出 H. camelinae 在有利条件下5天内可使发病率由5.2%升至43.3%，相关 Hyaloperonospora 病原可在接触植物表面约6小时后侵染，说明种子可作为初侵染源并促进病原在生长季间持久存在。植株内分布研究首次显示 H. camelinae 分布不均，顶端组织检出率最高，茎部检测可靠性低；无症状顶端可检出潜伏感染，可用于早期检测和化学防治决策。田间动态研究提示初侵染和两次次侵染的潜育期结束及产孢过程，降雨和高湿与产孢和传播相关；后期波动可能与其他胁迫或虫害有关。研究结论译文：本研究首次全面表征塞尔维亚由 H. camelinae 引起的亚麻荠霜霉病，包括基于形态和多基因系统发育的鉴定，并揭示此前未知的流行病学方面。尽管研究仅在单一地点开展，仍扩展了对 H. camelinae 流行病学的认识，记录种子感染，证明其对后代植株具有显著传播率，并识别出至少在塞尔维亚生产条件下的重要侵染源。病残体中卵孢子可能是额外侵染源，其意义尚需进一步确认；流行病学意义需未来多环境验证。采样策略、检测限和病株中病原不均匀分布应在早期病害检测和启动化学防治时予以考虑。同时，对塞尔维亚亚麻荠田侵染动态及初侵染和可能多次次侵染伴随接种体密度增加的认识，要求持续仔细监测和综合病害管理，包括种子健康检测、病残管理和及时施用杀菌剂，这对塞尔维亚亚麻荠生产中的霜霉病控制至关重要。