《Biomimetics》：Collagen Hydrolysate Prepared from Fish Skin as a Functional Biopolymer in Biomimetic Cosmetic Formulations
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胶原蛋白因其保湿、再生和成膜特性，是化妆品配方中的主要成分之一。本研究旨在通过一种中性、廉价的 hydrolysis 工艺，在低温（135 °C）和低压（315 kPa）条件下，并采用多种预处理程序（以去除鱼鳞、脂肪和残肉），从鲢鱼（Hypoph
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胶原蛋白因其保湿、再生和成膜特性，是化妆品配方中的主要成分之一。本研究旨在通过一种中性、廉价的 hydrolysis 工艺，在低温（135 °C）和低压（315 kPa）条件下，并采用多种预处理程序（以去除鱼鳞、脂肪和残肉），从鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）皮肤中获取生物相容性胶原蛋白水解物。对水解物样品的综合表征证实了其高纯度，表现为蛋白质含量超过10%、灰分未检出、pH值介于6至7之间。光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）成像进一步支持了这一结论，显示出特征性的纤维结构。此外，傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析和圆二色光谱（CD）验证了特定的无规卷曲结构，以及变性胶原蛋白特征性三螺旋结构的完全缺失。能量色散X射线光谱（EDX）结果确认了所有胶原蛋白水解物样品中存在C、O、N及微量S元素。针对大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）的微生物学分析结果显示，所有水解物样品中真菌和细菌完全不存在或含量可忽略不计，从而证明了提取工艺的有效性。体外生物相容性评估确定了所测样品的非细胞毒性浓度范围为1.25 mg/mL至10 mg/mL，细胞活力高于70%，乳酸脱氢酶（LDH）释放量低于5%。此外，所获鱼胶原蛋白水解物的临床斑贴试验未显示任何刺激反应。通过中性水解获得的鲢鱼皮胶原蛋白水解物，具有确定的特性和良好的生物相容性，被证明适用于化妆品应用。
论文解读文章
一、研究背景与意义
胶原蛋白是人体中含量最丰富的结构蛋白，约占总蛋白含量的30%，由三条多肽链缠绕形成由氢键稳定的特征性三螺旋结构，主要存在于结缔组织中，为皮肤、肌腱、软骨、骨骼和韧带提供机械强度和柔韧性。尽管I型胶原蛋白约占人体胶原蛋白总量的90%，但目前已发现共29种结构和组成上各异的胶原蛋白类型。目前，牛和猪来源的组织在医疗保健和工业领域被广泛使用，但其应用日益受到病毒传播风险以及伦理和宗教限制的制约。一些制造商拒绝使用哺乳动物胶原蛋白，转而偏好其他来源。
为应对这些限制，海洋胶原蛋白作为一种有前景的替代方案出现，可降低与可传播哺乳动物疾病相关的风险，如牛海绵状脑病（BSE）、可传播性海绵状脑病（TSE）和口蹄疫（FMD）。因此，海洋来源的胶原蛋白在食品科学、生物工程、制药、化妆品和生物医学伤口愈合领域得到广泛应用。在化妆品行业内，正发生向仿生乳霜的重大范式转变，这类产品旨在模拟人类皮肤的自然结构。虽然天然化妆品常被视为环保，但其并不天然保证可持续性；因此，仿生学为制药和化妆品配方设计师提供了开发创新、高效且环境影响大幅降低的替代品的途径。
鱼类来源的胶原蛋白主要来源于海产品行业中价值被低估的副产品或废弃材料，符合循环经济原则，为传统聚合物提供了一种环境可持续的替代方案。同时，它规避了与牛和猪来源相关的伦理、社会宗教和健康挑战，获得了更广泛的消费者接受。因此，鱼胶原蛋白日益被采纳为先进化妆品配方中的首要仿生成分，有效满足了市场对清洁标签护肤品的需求，将生态责任与不妥协的产品性能相结合。
在大多数情况下，胶原蛋白的生产遵循酸法或酶法增溶工艺，其分离主要可从多种鱼类皮肤中实现。其他可用于从鱼类中提取胶原蛋白的方法包括超声处理、电渗析和CO2超临界流体法。将多样化的水产养殖副产品（皮肤、鳞片和骨骼）纳入这些提取流程可增强可持续性，最大限度地减少工业废物并优化资源效率。
作为一种可持续的替代方案，中性蛋白质水解——通常称为亚临界水水解（SWH）——利用温度在100–374 °C、压力在0.1–22 MPa范围内的水。这种环保的“绿色”加工技术避免了化学试剂，防止有毒废物产生，并显著缩短反应时间。SWH的基本机制依赖于亚临界条件下水合氢离子（H3O+）和氢氧根离子（OH?）的生成，这些离子有效充当催化剂。该方法已成功应用于各种富含蛋白质的食物废料，其中温度和压力等操作参数经过优化，以精确控制蛋白质向功能性肽或游离氨基酸的转化。
本研究旨在通过一种经济高效、在温和亚临界条件（135 °C和315 kPa）下优化的中性水解工艺，并在各种针对性预处理程序（旨在去除鱼鳞、脂肪和残留肉）之后，从鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）皮肤中开发生物相容性胶原蛋白水解物。
二、研究内容与主要技术方法
研究人员采用多种关键技术方法开展研究。首先采用多步骤预处理工艺，包括有机酸处理（乳酸、柠檬酸或1:1混合酸）、碱处理（0.1 M NaOH）、乙醇脱脂、过氧化氢脱色，随后进行中性亚临界水水解（SWH）（135 °C、315 kPa、6小时）和冷冻干燥，获得三种胶原蛋白水解物样品（Hcoll 1、Hcoll 2和Hcoll 3）。表征方法包括：物理化学分析（凯氏定氮法测定蛋白质含量、灰分测定、pH测定、水解度计算）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、圆二色光谱（CD）、光学显微镜、扫描电子显微镜（SEM）结合能量色散X射线光谱（EDX）、微生物学分析（总需氧微生物计数TAMC、酵母和霉菌总数TYMC、S. aureus和E. coli检测）、体外生物相容性评估（XTT细胞活力测定、LDH细胞毒性测定、划痕伤口愈合实验，使用人角质形成细胞HaCaT细胞系、人真皮成纤维细胞和人内皮细胞EA.hy926细胞系），以及体内临床斑贴试验（由Eurofins Evic Product Testing Romania SRL在受控皮肤科条件下进行，采用单次封闭式斑贴测试方法）。
三、研究结果
鱼胶原蛋白水解物的提取：提取产率数据显示，使用乳酸（Hcoll 1）的提取过程效率最高，其次是混合酸（Hcoll 3）和柠檬酸（Hcoll 2）。与文献中酸溶性胶原蛋白（ASC）和胃蛋白酶溶性胶原蛋白（PSC）的提取产率相比，本研究采用中性水解获得的产率值较低，差异归因于提取方法的不同。
物理化学表征：所有获得的鱼胶原蛋白水解物样品均表现出高纯度，蛋白质含量超过10%，灰分和脂肪含量低于检测限，pH值接近7，表明获得的水解物非常适合化妆品配方应用。水解度（DH）方面，Hcoll 1表现出最高的DH值（14.28%），提示较低的平均分子量（<10,000 Da），而Hcoll 2和Hcoll 3的估计分子量在13,000至20,000 Da之间，对应DH值分别为12.76%和5.68%。
红外光谱（FT-IR）：所有水解物样品均显示胶原蛋白官能团特有的吸收带，包括酰胺A带（N–H基团伸缩振动）、酰胺B带（亚甲基不对称伸缩振动）、酰胺I带（C=O）、酰胺II和III带（N–H变形振动与C-N和C-H伸缩振动耦合）。样品间未观察到显著差异。
圆二色光谱（CD）：所有样品在约196和200 nm处表现出显著的负带，高度指示无规卷曲结构；同时，约220 nm处正最大值的完全缺失证实了三螺旋结构的丧失，确认所有样品均为变性胶原蛋白——这是水解胶原蛋白的特征。
显微分析：光学显微镜显示胶原蛋白水解物均匀分布，形成大小和形状异质的颗粒聚集体。SEM图像显示所有样品中均存在独特的三维互连多孔网络，主要由折叠和皱褶片层组成，表明水解过程破坏了胶原蛋白颗粒的完整性，导致形态不规则，结构降解并伴随低分子量肽的存在。
能量色散X射线光谱（EDX）：EDX光谱和元素组成数据确认了所有胶原蛋白水解物样品中存在C、O、N（蛋白质百分比）和微量S，这些是蛋白质特有的元素。
微生物学分析：所有水解物样品中细菌数量极低，酵母和真菌以及致病或条件致病微生物均不存在，证明了所用提取工艺的安全性，样品可安全用于化妆品配方。
体外生物相容性评估：在24小时暴露后，角质形成细胞和真皮成纤维细胞中，除Hcoll 3最高浓度（20 mg/mL）导致轻微下降但仍高于70%阈值外，三种样品均未对线粒体功能产生负面影响。内皮细胞在最高浓度下活力下降至72.6–76.3%。72小时暴露后，角质形成细胞和真皮成纤维细胞活力在除最高浓度外的所有浓度下维持在对照的100%或以上；内皮细胞在20 mg/mL浓度下所有三种样品均显著受影响，活力低于对照的70%，提示细胞类型依赖性反应。LDH释放实验证实24小时孵育后所有测试浓度的细胞毒性均低于最大LDH释放的5%。划痕实验显示，与未处理细胞（55.8 ± 2.3%）相比，Hcoll 1从5 mg/mL起、Hcoll 2和Hcoll 3从20 mg/mL起伤口闭合显著减少，提示在角质形成细胞迁移重要的应用中需谨慎使用。
体内皮肤相容性评估：在限定实验条件下，所有测试胶原蛋白水解物的平均刺激评分与阴性对照无显著差异，而与阳性对照相比有统计学显著差异。记录的刺激值始终低于公认的皮肤反应性阈值，支持其被归类为非刺激性。在10 mg/mL浓度下，三种水解物均表现出非常好的皮肤相容性，样品间无统计学显著差异。
四、总结与结论
研究人员通过亚临界水水解（SWH）从鲢鱼皮肤中获得了生物相容性鱼胶原蛋白水解物。提取过程涉及多步骤预处理：先用有机酸处理以消除组织残留物，再用0.1 M NaOH溶液去除非胶原蛋白，随后用乙醇脱脂和过氧化氢脱色去除色素。最高提取产率由Hcoll 3获得（60.64%），紧随其后的是Hcoll 1（60.48%）和Hcoll 2（26.14%）。高纯度（蛋白质含量>10%、灰分未检出、pH 6–7）表明所有水解物样品可安全掺入化妆品配方。FT-IR和CD分析确认了无规卷曲结构。微生物学测试证实了提取工艺的安全性。体外测试表明在1.25至10 mg/mL浓度范围内无细胞毒性效应，LDH释放低于5%。斑贴试验在10 mg/mL浓度下未引起皮肤刺激，确认了其局部使用的安全性。
总之，本研究证明鱼皮中性水解是一种可持续且经济高效的胶原蛋白提取方法。通过避免使用酸或酶（否则需要后续中和）并利用低成本原材料，该提取程序在显著降低运营成本的同时最大限度地减少了环境影响。资源利用效率（鱼皮）与所得水解物高质量之间的优异平衡，凸显了该方法作为生产用于局部应用的生物活性胶原肽的可行、环保替代方案的价值。据研究人员所知，本研究建立了对各种酸预处理（比较使用多种酸）与亚临界水水解条件（SWH）相结合处理鲢鱼皮肤的新系统比较，通过评估提取产率、结构特征、生物相容性和皮肤刺激性，为利用所得胶原蛋白水解物于局部配方提供了全面基础。
