基于工程化减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的p53靶向递送治疗胶质母细胞瘤的探索性研究

《Biomedicines》：An Exploratory Study on the Targeted Delivery of p53 Using the Engineered Attenuated Salmonella Strain VNP20009 for the Treatment of Glioblastoma

　　

背景：胶质母细胞瘤（GBM）是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，治疗选择有限，部分原因在于其浸润性生长以及治疗剂难以递送至肿瘤组织。减毒鼠伤寒沙门氏菌菌株VNP20009表现出优先定植于肿瘤，并具有作为瘤内递送治疗剂载体的潜力。在本研究中，研究人员对VNP20009进行工程化改造，以递送肿瘤抑制蛋白p53用于GBM治疗。材料与方法：将包含prpsM启动子、SopE分泌信号和TP53基因的基因构建体导入VNP20009。评估工程化菌株的形态、生长动力学和转录特征。在GBM细胞中评估细胞内p53递送、细胞增殖和凋亡。在荷皮下GBM异种移植瘤小鼠中进一步评估抗肿瘤疗效、细菌生物分布和生物安全性。结果：工程化VNP20009菌株保留了与VNP20009-Vector对照相当的形态和生长特征，并且能够表达和递送p53。工程化细菌处理上调p21，并与GBM细胞中p53相关信号激活相关，抑制细胞增殖并诱导凋亡。在体内，工程化细菌优先积聚于肿瘤组织，增强瘤内p53表达，并显著抑制肿瘤生长。主要器官中仅检测到低细菌负荷，初步组织病理学安全性结果显示轻度肝脏改变。结论：本研究开发了一种基于工程化VNP20009的靶向递送p53至GBM的策略。通过将VNP20009固有的肿瘤趋向性与局部p53递送相结合，该方法在保持良好生物安全性特征的同时实现了显著抗肿瘤活性。这些发现支持进一步开发细菌介导的蛋白递送作为GBM的潜在治疗策略。

研究背景：胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是脑实质最常见的原发恶性肿瘤，恶性程度高、预后差，5年生存率低于5%，可因肿瘤压迫导致颅内压增高和局灶性神经功能缺损。一线手术联合放疗或化疗疗效有限，电场治疗费用较高，因而需要安全、有效、可及的生物治疗替代方案。细菌肿瘤治疗具有历史基础；减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009经purI敲除和msbB突变后毒性降低并增强肿瘤靶向定植，且依赖外源嘌呤增殖，并具有III型分泌系统（type III secretion system，T3SS）作为蛋白递送基础。GBM浸润性生长使治疗剂难以充分进入肿瘤组织；生物信息学分析提示TP53在GBM中高频突变、异常表达且p53信号通路显著富集，但高TP53表达可能主要反映突变TP53的积累/稳定而非野生型p53功能增强。因此，研究人员构建工程化VNP20009递送p53，评估其抗肿瘤活性与生物安全性，以建立可行的细菌介导GBM治疗策略。

主要关键技术方法（≤250字）：研究人员利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）153例GBM与基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression，GTEx）2642例正常脑组织进行差异表达和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析，并结合TCGA突变数据及肿瘤免疫单细胞中心（Tumor Immune Single-cell Hub，TISCH）GSE84465数据集3533个细胞进行突变景观和单细胞分析；构建prpsM-SopE-FLAG-TP53及TP53 S121F等构建体并电转入VNP20009，经16S rRNA测序、扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）、生长曲线、动态光散射（dynamic light scattering，DLS）/zeta电位和原核转录组表征；U251细胞以感染复数（multiplicity of infection，MOI）100共培养后行Western blotting、CCK-8、克隆形成和Annexin V-FITC/PI流式检测；BALB/c裸鼠U87MG皮下移植瘤行瘤内注射1×10⁶菌落形成单位（colony-forming units，CFU），每3–4天共3次，行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色、免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）及器官/肿瘤细菌培养；U251转录组行KEGG富集分析。

研究结果：
3.1. Bioinformatic Analyses Implicate TP53 and p53-Related Pathways in GBM：对TCGA 153例GBM与GTEx 2642例正常脑组织差异表达分析，KEGG显示p53信号通路显著富集；TCGA突变数据分析显示TP53为GBM高频突变基因；TISCH GSE84465单细胞分析显示TP53在恶性细胞簇表达最高，但原文强调高TP53表达可能反映突变TP53积累/稳定而非野生型p53活性增强，故治疗策略应聚焦恢复或补充野生型p53功能。
3.2. The Engineered Strains Showed No Obvious Morphological Alterations and Exhibited Growth Profiles Comparable to Those of the VNP20009-Vector Control：构建prpsM-SopE-FLAG-TP53及增强型TP53构建体并电转入VNP20009，16S rRNA测序确认菌株身份；SEM未见明显形态差异，生长曲线、粒径分布和zeta电位相近；原核转录组聚类显示增强型TP53未显著改变细菌表达谱，且与TP53组更相似，P53/增强P53与Vector间差异表达基因较多，而二者之间较少。
3.3. The Engineered Bacteria Have Demonstrated Good Antitumor Activity In Vitro：U251细胞（TP53突变）共培养后Western blotting示总p53蛋白无明显升高但p21升高，提示p53相关信号激活；CCK-8示48 h时VNP20009-P53和VNP20009-Enhanced P53组细胞活力显著降低；克隆形成试验示两治疗组集落形成几乎完全被抑制；流式示VNP20009-P53组总凋亡率10.81%（较NC增加9.44个百分点），增强P53组最高为17.38%（较NC增加16.01个百分点）。
3.4. The Engineered Bacteria Demonstrate Good Antitumor Activity and Safety In Vivo：U87MG皮下裸鼠模型瘤内注射后，肿瘤平均体积由对照1145±152 mm³降至429±74 mm³，减少62.5%；瘤内p53蛋白总体较高但存在个体差异；HE示肿瘤组织损伤，IHC示Ki-67和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）降低；肾、脾未见明显组织病理异常，肝见轻度炎症改变；细菌培养示肿瘤优先积聚，主要器官低。原文指出疗效可能由细菌载体和p53 payload共同贡献。
3.5. Investigation of the Antitumor Mechanisms of Engineered Bacteria：U251细胞转录组KEGG分析示p53信号通路在VNP20009-P53 vs NC和VNP20009-Enhanced P53 vs NC中显著富集，而VNP20009-Vector vs NC未观察到；凋亡信号通路亦显著富集，提示工程菌可能通过激活凋亡信号通路介导抗肿瘤作用。

讨论与结论翻译：讨论部分指出，本研究创新在于将VNP20009从单纯细菌治疗改造为具有肿瘤靶向能力的“活递送载体”和“原位蛋白表达平台”，利用其肿瘤趋向性递送野生型p53和增强型p53，形成“肿瘤富集—局部蛋白表达—肿瘤生长抑制”策略；局部表达理论上可减少系统循环中蛋白降解、短半衰期和低生物利用度问题，并降低系统暴露毒性。T3SS递送效率受输出机器结构、内源底物竞争、蛋白稳态、代谢负担、N端靶向序列和货物兼容性影响；Green等及既往Salmonella T3SS工程研究提示优化输出基础设施可提高递送，但本研究未直接量化胞外p53分泌、宿主细胞转位效率和p53生化稳定性。安全性方面，VNP20009的msbB突变降低内毒素相关毒性，purI缺失使其依赖外源嘌呤；初步组织病理学示肾、脾无明显异常，肝仅轻度炎症。作者指出局限包括未充分区分VNP20009载体本身与p53 payload的贡献；皮下移植瘤不能复现颅内微环境、血脑屏障和浸润性生长；U251为TP53突变，体内采用U87MG；未直接评估正常细胞毒性；系统安全性指标（血清生化、血液学、体重）未系统评估；基因稳定性、生物containment和临床相关给药途径仍需研究；未来需空载体对照、原位/患者来源/免疫健全模型及纳米整合等研究。研究结论翻译：研究人员已成功开发并验证一种基于修饰VNP20009菌株治疗GBM的新方法。该方法利用细菌定植肿瘤并原位递送治疗剂的能力，显示出显著治疗疗效和良好安全性，为克服当前GBM治疗挑战提供了新见解和实验证据。