原发性血小板增多症血浆代谢组学特征：通路水平改变及其与治疗状态、血小板计数和JAK2V617F状态的关系

《Metabolites》：Plasma Metabolomic Profiling in Essential Thrombocythemia: Pathway-Level Alterations and Their Relationship to Treatment Status, Platelet Count, and JAK2V617F Status

　　

中文翻译（摘要部分）：

背景/目的：原发性血小板增多症（essential thrombocythemia, ET）是一种由JAK-STAT信号驱动的骨髓增殖性肿瘤，其代谢表型尚未完全明确。本研究旨在刻画ET患者的血浆代谢组特征，并探究该特征是否随JAK2V617F状态、血小板计数（≥450×10⁹/L 与 <450×10⁹/L）以及细胞减灭治疗而改变。方法：研究人员采用液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）技术对70例ET患者和47例健康对照者进行非靶向血浆代谢组学分析。多变量分析采用主成分分析（principal component analysis, PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA），并通过嵌套交叉验证和置换检验进行验证。差异丰度代谢物以倍数变化（fold-change, FC > 1.5或<0.67）及Benjamini–Hochberg错误发现率（false discovery rate, q < 0.05）定义；代谢物鉴定注释为Level 1（保留时间匹配的 Authentic 标准品）或Level 3（仅分子式），并通过Reactome通路过表达分析（over-representation analysis）进行通路分析。结果：PCA和PLS-DA可将ET患者与对照者区分（PLS-DA R2Y=0.96；嵌套交叉验证Q2=0.91；置换检验p=0.001）。共有19种代谢物符合标准：7种为Level 1鉴定（琥珀酸、一种氨基丁酸异构体、尿苷和N-乙酰苯丙氨酸在ET中升高；脯氨酸、葡糖醛酸内酯和喹哪啶酸在ET中降低），12种为Level 3候选物，以血小板来源的类二十烷酸为主，包括11-脱氢血栓烷B2（在26%的对照者和99%的ET患者中检出）和血栓烷B2（分别为4%和84%）、前列腺素D2/E2及B1/A1异构体、一种羟基二十二碳六烯酸异构体以及皮质类固醇中间体。Reactome过表达分析主要基于Level 3候选物，将前列腺素和血栓烷合成及花生四烯酸代谢列为最高富集通路（FDR 7×10^-5），其次是脂肪酸代谢、嘧啶分解代谢，以及（仅基于Level 3候选物）盐皮质激素生物合成。该代谢特征在细胞减灭治疗、血小板计数和JAK2V617F各分层中的方向相似。结论：这些探索性数据描述了接受阿司匹林治疗的ET患者血浆代谢特征，以血小板来源的类二十烷酸为主，同时伴有琥珀酸和嘧啶相关代谢物的变化以及皮质类固醇中间体的候选性改变；由于阿司匹林暴露与疾病状态完全混杂，该特征需在独立队列中采用靶向方法加以验证。

论文解读

一、研究背景与问题

原发性血小板增多症（essential thrombocythemia, ET）是一种费城染色体阴性的骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasm, MPN），以持续性血小板增多和巨核细胞增殖为主要特征，年发病率约为1~2/10万，多见于60岁左右人群，血栓和出血事件是其主要致残原因。约半数至三分之二的ET患者携带JAK2V617F突变，另有约五分之一携带CALR突变、少数携带MPL突变，这些驱动突变均可激活JAK-STAT信号通路并支持细胞因子非依赖性祖细胞生长。约10%~15%的ET患者为三阴性。即使携带相同驱动突变，患者的临床表现也存在差异，提示下游生物学因素可能调节疾病表型。目前ET的管理采用风险适应性策略：低风险患者给予抗血小板治疗，高风险患者给予羟基脲或干扰素-α等细胞减灭治疗，但疾病控制仍不理想，现有生物标志物对个体血栓风险和疗效的预测能力有限。

代谢组学可测量细胞生化的小分子输出，补充基因组和转录组信息。在血液系统恶性肿瘤中，代谢组学研究已发现多种具有病理生物学和潜在治疗意义的失调通路。在MPN中，多项证据表明JAK-STAT持续性激活与代谢改变相关：JAK2V617F信号支持糖酵解和合成代谢脂质代谢；慢性炎症性细胞因子信号扰乱全身代谢；血小板高反应性与花生四烯酸处理和类二十烷酸生物合成改变有关。然而，ET的血浆代谢组尚未在决定患者管理的临床变量（驱动突变状态、血小板负荷、细胞减灭治疗）中进行系统表征。因此，本研究旨在生成ET血浆的非靶向代谢组图谱，并确定该特征是否随上述临床分层而改变。

二、研究设计与方法概览

该前瞻性研究于2024年12月至2025年12月进行，经机构伦理委员会批准，遵循《赫尔辛基宣言》。共纳入70例按WHO 2022标准确诊的ET患者（JAK2V617F阳性53例，阴性17例，其中6例CALR阳性，11例三阴性），以及47例年龄和性别匹配的健康对照者。所有ET患者在采样时均接受低剂量阿司匹林（100 mg每日一次），对照组无一人服用阿司匹林或其他药物。研究人员从空腹外周血中分离血浆，采用液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-Q-TOF/MS）进行非靶向代谢组学分析。数据处理使用MZmine 2.53，特征经空白过滤后保留3813个。多变量分析采用主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），模型效度通过嵌套交叉验证和1000次置换检验评估。差异代谢物以倍数变化（FC>1.5或<0.67）和Benjamini–Hochberg校正后q<0.05定义，鉴定级别分为Level 1（准确质量和保留时间匹配Authentic标准品）和Level 3（仅分子式）。通路过表达分析使用Reactome v97（超几何检验，Benjamini–Hochberg校正）。亚组分析按细胞减灭治疗、血小板计数（≥450×10⁹/L vs <450×10⁹/L）和JAK2V617F状态进行描述性比较。

三、主要研究结果

3.1 ET患者与健康对照者的比较

ET组与对照组在年龄、性别分布和平均白细胞计数方面无显著差异。对照组中位血红蛋白显著高于ET组，研究人员认为主要原因是健康对照者中献血者占很大比例，且ET组中大部分患者接受了细胞减灭治疗。正如预期，ET组中位血小板计数显著高于对照组。治疗指征最常见为单独年龄（38.6%，27/70），其次为单独血小板计数升高（31.4%，22/70），血栓栓塞史作为唯一指征占5.7%，另有12.9%无记录。

3.2 多变量分析与整体区分

两次进样（1例对照、1例ET患者）失败被排除，最终分析包括46例对照和69例ET患者。空白过滤后保留3813个特征；合并QC进样中，中位变异系数为37%。非监督PCA沿第一主成分分离ET与对照（PC1 8.0%，PC2 4.5%）。两成分PLS-DA模型R2Y=0.960，嵌套交叉验证Q2=0.91，交叉验证分类准确率为99%~100%，1000次标签置换均未达到观测Q2（p=0.001）。216个特征VIP>1.0。未进行分段中心化时，组间分离出现在第二主成分，提示运行顺序效应已被正确校正。

3.3 差异丰度代谢物

共有19种代谢物达到差异标准。Level 1鉴定中，ET组升高的有琥珀酸（FC 3.7）、一种氨基丁酸异构体（FC 2.0）、尿苷（FC 1.8）和N-乙酰苯丙氨酸（FC 3.5）；降低的有脯氨酸（FC 0.58）、葡糖醛酸内酯（FC 0.46）和喹哪啶酸（FC 0.32）。Level 3候选物中，差异最大的一组为血小板来源的类二十烷酸：11-脱氢血栓烷B2（FC 106）、血栓烷B2（对照4% vs ET 84%检出）、前列腺素D2/E2（C20H32O5）异构体（FC 32）、前列腺素B1/A1（C20H32O4）异构体（FC 11）、15-酮基前列腺素E2（C20H30O5）异构体（FC 19）、白三烯A4（C20H30O3）异构体（15% vs 100%检出）以及一种羟基二十二碳六烯酸（hydroxy-docosahexaenoic acid, HDHA）异构体（FC 12）。此外，4种皮质类固醇候选物（11-脱氢皮质酮、18-羟基皮质酮、11-脱氧皮质酮和孕烯醇酮，以甲酸加合物形式观察到）在对照组中检出率为0%~2%，在ET患者中为88%~100%。丙酮酸（FC 1.7；q=0.022）也达到差异标准。尿酸、皮质醇、甘氨鹅脱氧胆酸盐、LysoPC(18:1/0:0)、泛醇-8、13,14-二氢视黄醇和邻苯二酚等特征在组间无差异。

3.4 通路富集分析

19种差异代谢物中有12种可映射至Reactome，其中8种为Level 3候选物，因此通路分析被视为假设产生性的。过表达分析将前列腺素和血栓烷合成（58个实体中4个；FDR 7.1×10^-5）和花生四烯酸代谢（170个中5个；FDR 7.1×10^-5）列为最高富集通路，其次为脂肪酸代谢、嘧啶分解代谢（51个中3个；FDR 1.0×10^-3）和盐皮质激素生物合成（20个中2个；FDR 3.1×10^-3）。仅限Level 1鉴定的敏感性分析保留了嘧啶分解代谢（51个中2个；FDR 9.0×10^-3）和核苷酸分解代谢（144个中2个；FDR 0.020）作为唯一具有多个匹配的代谢通路。

3.5 亚组分析：细胞减灭治疗、血小板计数和JAK2V617F状态

研究人员按细胞减灭治疗（有/无）、血小板计数（≥450 vs <450×10⁹/L）和JAK2V617F状态（阳性/阴性）分别计算差异代谢物的倍数变化，均为描述性比较，未进行假设检验。结果显示，核心代谢特征在每一分层中的方向一致，这是该分析的主要结论。类二十烷酸升高幅度在有/无细胞减灭治疗患者（11-脱氢血栓烷B2，FC 107 vs 116）及两个血小板计数分层（FC 130 vs 98）中相当。尿苷（FC 2.5 vs 1.7）和前列腺素B1/A1异构体（FC 13 vs 9.9）在JAK2V617F阴性患者中似乎更高，15-酮基前列腺素E2异构体在未接受细胞减灭治疗的患者中较低（FC 11 vs 21），但这些差异仅作为靶向随访的线索。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究的血浆代谢特征在细胞减灭治疗、血小板计数和JAK2V617F各分层中方向一致，表明该特征并非局限于某一临床亚组。然而，由于所有ET患者均服用低剂量阿司匹林而对照组均未服用，该特征被描述为“阿司匹林治疗的ET”的血浆特征，疾病、药物和血小板相关效应无法分离。研究强调了几个关键方法学限制：血浆仅经单次离心制备，未验证为血小板贫乏血浆，残余血小板可能贡献类二十烷酸信号；类二十烷酸在EDTA血浆中不稳定；皮质类固醇候选物以甲酸加合物形式观察，其质量与C22氧脂质的[M?H]^?离子等压，因此只能作为Level 3候选；所有Level 1鉴定仅基于准确质量和保留时间，未采集MS/MS谱图。阿司匹林暴露与疾病状态完全混杂，且未测量依从性和血小板环氧合酶-1抑制程度，因此不能将数据解读为阿司匹林不敏感型生物合成的证据。血小板计数与细胞减灭治疗存在共线性，亚组样本量小且不平衡，11例患者无法关联临床记录。QC变异系数（37%）高于理想水平。尽管存在上述局限，该研究是首个系统描述ET血浆代谢组并跨治疗、血小板和突变状态评估其一致性的探索性分析，为未来的靶向定量验证和机制研究提供了明确基础。

结论：对阿司匹林治疗的ET患者进行非靶向血浆代谢组学分析，揭示了一个以血小板来源的类二十烷酸（血栓烷B2、11-脱氢血栓烷B2和前列腺素异构体）为主的探索性特征，同时伴有琥珀酸、尿苷和丙酮酸升高，脯氨酸、葡糖醛酸内酯和喹哪啶酸降低，以及皮质类固醇中间体的候选性改变；该特征在细胞减灭治疗、血小板计数和JAK2V617F各分层中方向相似。由于阿司匹林暴露、血小板计数和疾病状态在本设计中无法分离，且所有类二十烷酸和类固醇注释均为分子式水平，这些发现属于假设产生性结果，需在独立队列中采用靶向定量方法加以确证。