《Bioengineering》：A Two-Layered Agar Matrix for 3D Cancer Cell Culture in Experimental Radiotherapy
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癌症模型模拟天然肿瘤环境的程度越高，在该环境中测试的新型治疗方法在临床试验中成功的可能性就越大。三维（3D）细胞培养模型相较于简单的单层二维（2D）细胞培养具有多项优势：它能够更贴近地模拟侵袭活体生物的自发性肿瘤中所发生的癌细胞相互作用。三维培养可用于模拟更大
癌症模型模拟天然肿瘤环境的程度越高，在该环境中测试的新型治疗方法在临床试验中成功的可能性就越大。三维（3D）细胞培养模型相较于简单的单层二维（2D）细胞培养具有多项优势：它能够更贴近地模拟侵袭活体生物的自发性肿瘤中所发生的癌细胞相互作用。三维培养可用于模拟更大的癌细胞负荷，从而对治疗干预的破坏效果构成更高挑战。在该模型中，三维结构中心的营养支持将随着直径的增加而减少，这与快速生长肿瘤中的情况相似。为实验放射治疗之目的，研究人员设计了一种基于双层琼脂基质的三维癌细胞模型。尽管该模型并不能代表复杂的肿瘤微环境，但研究人员利用同步辐射光源微计算机断层扫描（microCT）成像技术，成功实现了对负载金纳米颗粒（GNP）并在琼脂基质中注射增殖的癌细胞三维生长过程的可视化。研究人员还使用微束对三维细胞培养物进行了辐照，随后按照有机组织样本的处理方式对琼脂基质进行了包埋、切片和染色。由此，研究人员证明了该体外模型在实验放射治疗中的适用性。
三维肿瘤模型在实验放射治疗中的研究进展与双层琼脂基质培养系统的建立
一、研究背景与意义
在肿瘤治疗新方法的研发过程中，体外模型对体内治疗反应的预测准确性至关重要。传统的二维（2D）细胞培养模型虽广泛应用于基础研究，但其无法真实模拟体内肿瘤复杂的微环境，包括细胞间相互作用、细胞外基质成分与结构、以及营养梯度等关键参数，导致基于二维培养获得的治疗预期往往与临床实际结果存在显著偏差。三维（3D）肿瘤模型的兴起为提高体外研究结果的临床转化价值提供了新的可能。目前已有的三维培养体系包括肿瘤球体、芯片器官、三维打印肿瘤及类器官等，但这些系统普遍存在制备成本高昂、对专业技术设备依赖性强、样本通量低等问题，难以满足大规模实验放射生物学研究对高样本数量和可重复性的需求。
在临床放射肿瘤学中，肿瘤大小和深度是治疗计划制定的关键物理参数。而在实验放射治疗领域，尤其是微束放射治疗（MRT）和空间分割放射治疗（SFRT）等新技术研发中，需要一种能够模拟实体肿瘤结构、具备足够机械稳定性以支持反复操作、可进行高密度细胞培养并适用于辐照后组织学分析的三维体外模型。此外，在同步辐射光源等大型科研设施开展实验时，由于机时竞争激烈且用户通常需长途运输样本，对样本的制备便捷性、运输稳定性和实验现场可操作性提出了更高要求。基于上述需求，研究人员开发并验证了一种成本低廉、制备简便、机械稳定性良好的双层琼脂基质三维癌细胞培养系统。
二、研究内容与主要技术方法
研究人员构建了一种由2%琼脂底层和0.2%–0.4%琼脂顶层组成的双层琼脂基质三维细胞培养系统。底层提供机械支撑，顶层供肿瘤细胞三维增殖。研究使用了三种癌细胞系：大鼠F98胶质瘤细胞、小鼠B16-F10黑色素瘤细胞和人A549肺癌细胞。主要技术方法包括：金纳米颗粒（GNP）合成与细胞负载标记技术，用于同步辐射微计算机断层扫描（microCT）三维成像；同步辐射微束辐照技术，在PETRA III同步辐射光源P61A白光束线站对培养样本实施微束放射治疗（MRT），峰值剂量达400 Gy；组织学处理技术，包括乙醇梯度脱水、石蜡包埋、5 μm厚度切片及苏木精-伊红（H&E）染色和尼氏（Nissl）染色；免疫荧光染色技术，用于γ-H2AX DNA双链断裂标记检测。
三、研究结果
3.1 机械稳定性
研究人员通过跨孔板转移和长途航空运输测试评估了琼脂基质的机械稳定性。在120个样本中，经航空运输后完整率达90.8%，转移至辐照培养皿后完整样本率为89%，实验过程中无进一步样本损失。基质可被切割为直径7 mm的圆柱形片段，并支持反复插入动物体模而不影响其完整性。
3.2 癌细胞生长模式可视化
研究人员通过二维培养增殖实验确认，GNP负载对三种癌细胞系的增殖无显著统计学影响。利用同步辐射microCT成像，成功实现了对琼脂基质中GNP负载F98胶质瘤细胞三维分布的可视化，证实了细胞在基质内呈三维生长模式。
3.3 组织学与免疫荧光分析
辐照后的琼脂基质经包埋、切片和染色处理，在H&E和Nissl染色切片中清晰观察到微束照射轨迹，表现为辐射所致细胞损伤后固缩细胞核形成的深色线条。通过ImageJ软件对H&E切片进行强度剖面分析，微束中心间距测量值为398.3 μm、396.7 μm和397.2 μm，与理论值400 μm相比收缩率小于1%，证实了辐照几何结构的精确保持。未辐照对照组切片中未观察到峰值剂量特征。γ-H2AX免疫荧光染色虽显示部分DNA损伤信号，但未能清晰呈现微束轨迹线条，这是本研究的一个局限性。
四、讨论与结论
本研究所建立的双层琼脂基质三维细胞培养系统具有制备简便、成本低廉、样本通量高的优势，能够满足同步辐射实验放射生物学研究对大量样本快速制备和处理的特殊需求。该系统可模拟实体肿瘤的三维结构和尺寸特征，并可通过插入组织等效材料制成的人体或动物体模实现解剖学模拟。研究确认了鼠源和人源癌细胞均能在该系统中形成三维培养结构，样本可按照有机组织处理标准进行切片、染色和形态学分析。微束辐照后的组织学分析能够反映辐射诱导的细胞损伤模式，验证了该系统在MRT研究中的适用性。
研究结论指出，该双层琼脂基质三维细胞培养模型可有效用于实验放射治疗研究，特别是MRT研究。样本具备足够的机械稳定性以支持从培养板取出、按实验要求切割成型、插入体模以及非理想条件下的运输。该系统是一种快速、简便、低成本的实验工具，适用于放射治疗技术研发中的辐照研究和成像研究。
