细胞色素P450基因在苜蓿跳甲对新烟碱类杀虫剂不同抗性种群中的转录响应

《Agriculture》：Transcriptomic Responses of Cytochrome P450 Genes in Monolepta signata Populations with Differential Resistance to Neonicotinoids

　　

摘要：苜蓿跳甲（Monolepta signata，鞘翅目：叶甲科）是东亚和东南亚地区的一种重要农业害虫。细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）基因通常参与外源化合物的解毒代谢，但其在该害虫对新烟碱类杀虫剂响应中的作用尚不清楚。本研究整合了抗性生物测定与转录组分析，以探究与噻虫嗪（thiamethoxam）和吡虫啉（imidacloprid）胁迫相关的基因表达模式。基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析表明，与代谢和细胞过程相关的通路受到杀虫剂暴露的影响。研究人员鉴定出7个差异表达的P450基因，分别属于CYP3、CYP4和CYP12分支。在6个田间种群中，CYP4C1和CYP6a23的本底表达水平与噻虫嗪相对抗性比率呈显著正相关，而其表达水平与吡虫啉相对抗性比率之间未检测到显著相关性。然而，在排除BETL种群后，这两种相关性均不再显著，表明该相关性主要由这一个种群驱动。这些基因的组成型过表达可能与噻虫嗪抗性表型相关。仍需功能验证来阐明它们的具体作用。本研究为这种害虫的抗性监测和综合治理提供了有价值的转录组资源。

一、研究背景与科学问题

苜蓿跳甲是一种多食性害虫，寄主范围广泛，可危害玉米、棉花、高粱和大豆等多种经济作物，分布于东亚和东南亚十余个国家和地区，在中国北方地区暴发尤为严重。目前化学防治仍是其主要防控手段，但长期和不合理施用杀虫剂导致抗药性问题日益突出。新烟碱类杀虫剂如噻虫嗪和吡虫啉作为农业上广泛使用的系统性杀虫剂，通过与昆虫神经元突触后膜上的烟碱型乙酰胆碱受体结合，干扰神经信号传导，最终导致害虫麻痹死亡。然而，随着这些药剂在新疆棉田和玉米田中持续用于防治苜蓿跳甲，其田间种群的敏感性已出现分化，抗性风险不容忽视。

在杀虫剂选择压力下，昆虫进化出多种抗性机制，包括行为改变、靶标位点突变以及由差异表达基因介导的代谢解毒增强。其中，细胞色素P450单加氧酶是多种昆虫产生杀虫剂抗性的核心机制之一，几乎参与所有类别杀虫剂的代谢解毒。尽管已有研究证实P450基因在其他鞘翅目害虫中对新烟碱类杀虫剂的代谢作用，但在苜蓿跳甲中，P450基因如何响应噻虫嗪和吡虫啉胁迫仍不清楚。因此，鉴定与该害虫对新烟碱类杀虫剂响应相关的候选基因，阐明其适应杀虫剂的分子通路，对于理解和延缓抗性演化至关重要。

二、研究方法与技术路线

研究人员于2025年7月从新疆维吾尔自治区的石河子市（SHZ）、沙湾市（SW1、SW2、SW3）、乌苏市（WS）和博尔塔拉蒙古自治州（BETL）共采集6个苜蓿跳甲田间种群。采用叶片浸渍法测定各种群对噻虫嗪和吡虫啉的半数致死浓度，并以LC₅₀最低的SW2种群作为田间参照种群计算相对抗性比率。选取相对抗性较高的SHZ和BETL种群进行后续转录组测序。通过Illumina NovaSeq X Plus平台进行双端测序，利用Trinity软件进行从头转录组组装，并使用DESeq包鉴定差异表达基因。采用实时荧光定量PCR对7个候选P450基因的表达进行验证，以Ef1α作为内参基因。使用Pearson相关性分析评估本底基因表达水平与杀虫剂相对抗性比率之间的关联。

三、研究结果

3.1 转录组全基因组分析

通过火山图比较发现，不同比较组间差异表达基因数量差异显著：BETL对照与SW2对照间有1974个差异表达基因（1394个上调，580个下调），SHZ对照与SW2对照间有1159个差异表达基因（829个上调，330个下调），SW2经噻虫嗪处理后与对照间有4098个差异表达基因（3671个上调，427个下调），SW2经吡虫啉处理后与对照间有2020个差异表达基因（1707个上调，313个下调）。GO富集分析显示，生物学过程类别中以细胞过程和代谢过程为主，细胞组分类别中细胞解剖实体占比最高，分子功能类别中催化活性富集基因最多，其次为结合功能。KEGG通路富集分析发现，溶酶体、吞噬体和凋亡等通路在不同比较组中均有显著富集。

3.2 RT-qPCR验证

对6个田间种群中7个P450基因的本底表达水平进行比较，发现各基因在不同种群间的表达量存在显著差异。在SW2种群中，噻虫嗪和吡虫啉处理均显著下调了CYP3A19和CYP6a20的表达。在高抗性BETL种群中，噻虫嗪处理显著抑制了CYP4C1和CYP6a23的转录水平。在SHZ种群中，吡虫啉暴露显著上调了CYP6a20，同时显著下调了CYP4C1和CYP6a23。

3.3 抗性水平与P450基因表达的相关性分析

在6个田间种群中，CYP4C1和CYP6a23的本底转录丰度与噻虫嗪相对抗性比率呈强正相关（相关系数分别为0.938和0.936，p值均为0.006），经多重检验校正后仍显著。这两个基因的表达与吡虫啉抗性无显著相关性。然而，在排除BETL种群后，CYP4C1和CYP6a23与噻虫嗪抗性的相关性均不再显著，表明原始相关性主要由BETL这一个高抗性高表达种群驱动。

四、讨论与结论

讨论部分指出，不同地理来源的苜蓿跳甲田间种群对噻虫嗪和吡虫啉的敏感性存在差异，其中BETL种群对噻虫嗪的相对抗性最高，SHZ种群对吡虫啉的相对抗性最高。GO和KEGG富集分析一致表明差异表达基因主要富集于代谢和细胞过程相关通路，这与前人关于昆虫解毒机制的转录组研究结果相符。值得注意的是，CYP4C1和CYP6a23的本底表达与噻虫嗪抗性的正相关性强烈受BETL种群影响，该种群同时具有最高的噻虫嗪抗性和最高的这两个基因本底转录水平。此外，这两个基因在BETL种群经噻虫嗪处理后反而被显著下调，这种本底差异与诱导变化方向相反的现象提示复杂的转录调控机制。其他四个P450基因（CYP3A19、CYP6a8、CYP6a20和CYP6k1）在抗性种群中并未持续上调，表明它们虽能响应新烟碱类胁迫，但不太可能是决定田间种群抗性的主效基因。研究还指出，由于未建立标准敏感品系，相对抗性比率是基于田间参照种群SW2计算的；杀虫剂处理样本为LC₅₀暴露48小时后存活的成虫，其表达变化包含了直接杀虫剂响应和存活选择效应的混合影响；引物扩增效率未经标准曲线验证，因此RT-qPCR相对表达值应视为半定量数据。

结论部分：在6个田间种群中，CYP4C1和CYP6a23的本底表达与噻虫嗪相对抗性比率呈正相关；然而，这种相关性主要由BETL种群驱动，排除该种群后相关性消失。这些基因在田间种群间表现出不同的本底表达模式以及在杀虫剂暴露后不同的表达变化模式，暗示它们在响应新烟碱类胁迫时可能存在功能分化。然而，鉴于研究设计和种群背景的限制，它们与抗性的直接关系尚无法确认。总体而言，这些P450基因可作为进一步机理研究的候选基因，其解毒功能和调控通路仍需通过异源表达、RNA干扰和更多种群研究来验证。