《Viruses》：Multi-Omic Profiling and Functional Validation Identify an NF-κB-Centered Pro-Survival Network Underlying Resistance to Oncolytic VSV in Prostate Cancer Cells
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溶瘤病毒的治疗效果常常受到肿瘤细胞抵抗病毒介导杀伤作用的限制。在此，研究人员利用VSV敏感的LNCaP细胞系作为对照，研究了侵袭性转移性前列腺癌细胞系PC3对水疱性口炎病毒（VSV）抵抗的分子机制。RNA测序结果显示，与未处理细胞相比，VSV感染的PC3细胞同
溶瘤病毒的治疗效果常常受到肿瘤细胞抵抗病毒介导杀伤作用的限制。在此，研究人员利用VSV敏感的LNCaP细胞系作为对照，研究了侵袭性转移性前列腺癌细胞系PC3对水疱性口炎病毒（VSV）抵抗的分子机制。RNA测序结果显示，与未处理细胞相比，VSV感染的PC3细胞同时上调了促凋亡基因（包括BIM、PUMA和NOXA）以及抗凋亡和抗病毒基因（包括A20和RIG-I）。此外，与LNCaP细胞相比，PC3细胞中与抗病毒和前生存通路相关的基因（包括NF-κB和PI3K-Akt信号通路）表达水平更高。在基线状态下，与LNCaP细胞相比，PC3细胞也表现出前生存基因（包括BCL-xL、MCL1和CK2）的高表达。互补的磷酸化蛋白阵列分析发现，与感染的LNCaP细胞相比，VSV感染的PC3细胞中与NF-κB、PI3K-Akt和MSK1信号通路相关的蛋白磷酸化水平增加。此外，对BCL-2家族蛋白或NF-κB信号通路的药理学抑制可使PC3细胞对VSV诱导的细胞死亡敏感化。这些发现支持一个模型，即NF-κB为中心的前生存信号网络有助于PC3细胞的抵抗表型，并提示将溶瘤病毒疗法与靶向抑制剂相结合可能会提高耐药性前列腺癌的治疗效果。
研究背景与科学问题
溶瘤病毒作为新兴的癌症治疗手段展现出良好前景，其中水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus，VSV）因其广泛的细胞嗜性及在人类中缺乏预存免疫而被广泛研究。VSV在肿瘤细胞中的选择性溶瘤活性部分与许多肿瘤中存在的I型干扰素（type I interferon，IFN）信号缺陷相关。然而，尽管临床前和早期临床研究结果令人鼓舞，部分肿瘤仍保留有效的抗病毒防御机制，从而对VSV介导的溶瘤作用表现出抵抗性。前列腺癌（prostate cancer，PrCa）是男性最常见的恶性肿瘤，早期局限性患者5年生存率接近100%，但约30%的患者确诊时已发生转移，尤其是去势抵抗性前列腺癌患者的预后显著较差。目前，关于肿瘤细胞如何在VSV感染后存活的具体分子机制仍不完全清楚，这限制了溶瘤病毒疗法的临床应用。
研究内容与核心发现
研究人员选用两株具有不同VSV敏感性的前列腺癌细胞系作为模型：来源于淋巴结转移且表达雄激素受体（androgen receptor，AR）的LNCaP细胞（VSV敏感），以及来源于骨转移且不表达AR、表型更具侵袭性的PC3细胞（VSV抵抗），后者被广泛用作去势抵抗性前列腺癌的模型。由于PC3细胞对VSV感染的抵抗性显著高于LNCaP细胞，研究人员采用不同的感染复数（multiplicity of infection，MOI）（PC3为50，LNCaP为10）以实现相当的感染频率和同步感染动力学。通过整合转录组学、磷酸化蛋白阵列和药理学干预手段，该研究系统解析了PC3细胞VSV抵抗的分子机制。研究发现，PC3细胞在基线状态下即高表达多种抗凋亡/前生存基因，包括BCL-2家族成员BCL-xL、MCL1、BIRC2（cIAP1）、CK2以及NF-κB通路组分p100和RELB。VSV感染后，PC3细胞同时激活促凋亡程序（上调BIM、PUMA、NOXA）和前生存程序（上调A20、RIG-I、IFIT1和IFIT3），但细胞仍能存活，提示抵抗表型源于前生存信号在平衡中占据优势。磷酸化蛋白阵列分析进一步证实，VSV感染的PC3细胞中NF-κB（经典和非经典通路）、PI3K-Akt及MSK1信号通路相关蛋白磷酸化水平升高。功能验证实验表明，使用BCL-2家族抑制剂（ABT-199、ABT-737）或NF-κB信号抑制剂（IKK16）处理可显著增强PC3细胞对VSV（野生型及减毒R1突变株）介导杀伤的敏感性。
主要技术方法
该研究采用多组学整合策略：RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）分析VSV感染后PC3和LNCaP细胞的转录组变化，使用DESeq2进行差异表达分析；KEGG通路富集分析（overrepresentation analysis，ORA）及pathview通路表达图谱绘制；NF-κB磷酸化蛋白抗体阵列（217种抗体）检测通路蛋白磷酸化水平变化；PrestoBlue细胞活力测定评估药物处理后的细胞存活率。细胞系均购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。
研究结果
3.1 PC3细胞对VSV感染产生应答并转录激活促凋亡基因
RNA-seq分析显示，VSV感染在两种细胞系中均诱导了显著的全局转录变化。在抵抗性的PC3细胞中，VSV感染诱导了促凋亡基因BCL2L11（BIM）、BBC3（PUMA）和PMAIP1（NOXA）的表达，同时也诱导了抗凋亡因子TNFAIP3（A20）以及抗病毒基因DDX58（RIG-I）、IFIT1和IFIT3的表达。这表明PC3细胞的抵抗并非源于凋亡通路激活失败，而是前生存信号在平衡中占据优势。
3.2 PC3细胞表达更高水平的抗凋亡/前生存基因
基线状态下，PC3细胞较LNCaP细胞高表达多种抗凋亡基因，包括BCL-2家族的BCL-xL、BIRC2（cIAP1）、CK2和MCL1，以及NF-κB通路组分p100和RELB。值得注意的是，LNCaP细胞中抗凋亡基因BCL-2的表达水平略高。PC3细胞中更丰富的前生存基因基线表达与其对VSV介导杀伤的更高抵抗性一致。
3.3 感染的PC3细胞选择性富集额外的应激和前生存通路
ORA分析显示，VSV感染的PC3细胞中p53、IL-17、凋亡和MAPK信号通路选择性富集，而TNF、细胞因子-细胞因子受体相互作用和NF-κB信号通路在两种细胞系中均有富集。
3.4 PC3细胞在基线状态下表现出更强的抗病毒和前生存通路表达
通路表达图谱显示，未感染的PC3细胞较LNCaP细胞高表达NF-κB通路中多个前生存基因（如BCL2A1和PLAU），PI3K-Akt通路中多个基因也呈现更高基线表达，同时TNF通路中多个促炎细胞因子和趋化因子（如IL6和CXCL1）以及凋亡通路中多个前生存基因（如BIRC2、TRAF1和BCL2A1）表达水平更高。
3.5 VSV感染维持PC3细胞中抗病毒和前生存通路的高表达
感染后，PC3细胞相对于LNCaP细胞持续维持NF-κB、PI3K-Akt、TNF、凋亡和前列腺癌通路中相关基因的高表达，部分基因的表达差异在感染后甚至进一步增大。
3.6 VSV感染与PC3细胞中NF-κB和Akt信号激活相关
磷酸化蛋白阵列分析显示，VSV感染的PC3细胞中PKR（Thr446）磷酸化水平升高，NF-κB经典和非经典通路多个家族成员在调控位点的磷酸化水平增加，PI3K-Akt通路相关蛋白磷酸化水平也升高。此外，IKKα和IKKβ水平降低，而MSK1磷酸化水平升高，提示额外的应激响应信号通路可能参与NF-κB依赖性转录。
3.7 BCL-2和NF-κB信号的药理学抑制功能验证其在PC3细胞VSV抵抗中的作用
使用ABT-199或ABT-737抑制BCL-2家族蛋白，或使用IKK16抑制NF-κB信号，均可显著降低VSV感染后PC3细胞的存活率。这一效应在野生型VSV和减毒R1突变株中均观察到，为BCL-2家族和NF-κB信号在PC3细胞VSV抵抗中的贡献提供了功能证据。
讨论与结论
该研究揭示了以NF-κB为中心的前生存信号网络在PC3细胞VSV抵抗中的核心作用。PC3细胞在基线状态下即存在组成性的前生存程序，VSV感染后这一程序被维持并进一步增强，同时伴随PI3K-Akt和MSK1信号的增强。研究人员提出，PC3细胞对VSV介导杀伤的抵抗源于感染后前生存与促凋亡信号平衡向前生存方向的倾斜。药理学上破坏NF-κB或BCL-2家族信号可使抵抗性细胞对VSV诱导的活力丧失敏感化，支持了这些通路在抵抗表型中的贡献。研究同时指出，BCL-2家族抑制剂存在临床相关毒性，需优化治疗方案以最大化肿瘤特异性杀伤并最小化正常组织毒性。该研究为溶瘤VSV抵抗机制提供了重要见解，支持进一步开发靶向前生存信号通路的联合治疗策略以改善侵袭性前列腺癌的治疗效果。研究局限性包括仅使用两株细胞系、不同MOI和感染后时间点可能导致的转录差异，以及功能验证依赖药理学抑制，未来需通过遗传学扰动进一步确证因果关系。
