TRIM69通过抑制细胞AMPK信号通路广谱限制RNA和DNA病毒复制并增强抗病毒基因表达

《Viruses》：TRIM69 Suppresses the Cellular AMPK Pathway to Inhibit Viral Replication

　　

干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes, ISGs）通过靶向病毒感染所需的病毒组分和细胞通路来建立抗病毒防御。研究人员发现，干扰素和病毒诱导的抗病毒因子TRIM69抑制细胞AMP激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）信号，并限制RNA病毒和DNA病毒的复制。TRIM69的异位表达抑制仙台病毒（Sendai virus, SeV）诱导的自噬，并在病毒感染和营养剥夺条件下抑制AMPK及其下游靶点ULK1（Unc-51 like autophagy activating kinase 1）的磷酸化。与抑制该促病毒AMPK信号通路一致，TRIM69表达强烈限制副黏病毒和肺病毒复制，包括SeV、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）、人副流感病毒3型（human parainfluenza virus type 3, HPIV3），以及疱疹病毒，例如单纯疱疹病毒1型（herpes simplex virus type 1, HSV-1）。与这些发现一致，内源性TRIM69敲低增强病毒复制，证明TRIM69具有生理性抗病毒作用。除抑制病毒复制外，TRIM69支持抗病毒基因表达，包括IFNB1、IFIT2和IFIT3，提示先天抗病毒信号放大。总之，这些发现确定TRIM69为一种广谱抗病毒ISG，其靶向细胞AMPK通路并促进宿主针对病毒的先天免疫反应。

研究背景与问题：I型干扰素（type I interferons, IFNs）通过诱导干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes, ISGs）建立抗病毒状态。三部分基序（tripartite motif, TRIM）蛋白家族是重要抗病毒效应因子，多具有E3泛素连接酶（E3 ubiquitin ligase）活性，可调控固有免疫信号、蛋白稳定性、细胞骨架和自噬（autophagy）。TRIM69已被报道限制登革病毒（dengue virus, DENV）、水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）等，并可通过微管稳定等机制发挥作用，但其对病毒常利用的宿主AMP激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）通路和自噬相关通路的调控尚不清楚。AMPK是细胞代谢和应激反应的核心调控因子，可被多种病毒利用，促进ULK1（Unc-51 like autophagy activating kinase 1）磷酸化和自噬；自噬在抗病毒防御中呈病毒特异性。此前TDRD7研究将AMPK确立为可被IFN诱导宿主因子靶向的促病毒信号节点。因此，研究人员探究TRIM69是否作为IFN和病毒诱导因子抑制AMPK/自噬并限制病毒复制。研究发现TRIM69抑制AMPK信号和自噬相关反应，广谱限制RNA和DNA病毒，并支持抗病毒基因表达，提示靶向AMPK依赖性促病毒程序可能是更广泛的抗病毒策略。

关键技术方法：研究人员采用稳定或瞬时过表达Flag-TRIM69及shRNA/siRNA敲低，在HT1080、HEK293T、L929、LA4、HeLa、A549、THP-1等细胞（ATCC）及人原代新生儿包皮成纤维细胞NuFF1（GlobalStem）中开展病毒感染实验；使用SeV、RSV-dsRED、HPIV3-GFP、小鼠肝炎病毒（murine hepatitis virus, MHV）A59、HSV-1 KOS/F和腺病毒5型（adenovirus type 5, Ad5），结合免疫印迹、qRT-PCR（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction）、免疫荧光及噬斑或TCID₅₀（50% tissue culture infectious dose）测定；用血清饥饿、Hanks平衡盐溶液（HBSS）和Compound C（CC）处理；体内使用C57BL/6小鼠（JAX）及定制Irf3^fl/fl、Irf3^D/D小鼠经鼻感染MHV或SeV 52株后检测肺组织；统计采用t检验或ANOVA。

3.1. TRIM69, an IFN-Stimulated Gene, Suppresses the Cellular AMPK/Autophagy Pathway：通过L929和HT1080细胞过表达Flag-TRIM69并检测SeV诱导的p62/SQSTM1（sequestosome 1）降解和LC3-II（microtubule-associated protein 1 light chain 3-II），显示TRIM69抑制自噬；通过检测SeV、HSV-1、血清饥饿和HBSS诱导的磷酸化AMPK（phospho-AMPK, pAMPK；Thr172）及ULK1磷酸化，过表达降低、敲低增加；通过IFNβ和RNA/DNA病毒感染及小鼠肺组织检测，显示TRIM69可被IFN和病毒诱导，SeV诱导部分依赖干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3, IRF3）。结论：TRIM69为IFN和病毒诱导因子，抑制AMPK/自噬通路。

3.2. TRIM69 Restricts Paramyxo- and Pneumovirus Replication：通过在LA4、HEK293T等细胞过表达TRIM69并检测SeV C蛋白、P mRNA和滴度，显示SeV复制受抑；Compound C与TRIM69均降低SeV C，且TRIM69在CC处理下无进一步抑制，提示AMPK抑制贡献；RSV dsRED、免疫染色和滴度及HPIV3 HN检测显示RSV和HPIV3复制受抑。结论：TRIM69限制副黏病毒和肺病毒。

3.3. TRIM69 Inhibits HSV-1 Replication：通过在HT1080和原代NuFF细胞过表达TRIM69并检测HSV-1 ICP0/ICP8及TCID₅₀，显示病毒蛋白和感染性颗粒减少。结论：TRIM69限制HSV-1复制。

3.4. Loss of TRIM69 Enhances Virus Replication：通过shTRIM69 HT1080细胞检测SeV C、HPIV3 GFP及HSV-1 ICP0/ICP8，显示敲低内源TRIM69增强病毒复制。结论：内源TRIM69具有生理性抗病毒作用。

3.5. TRIM69 Supports the Antiviral Innate Immune Responses：通过A549细胞siRNA敲低TRIM69并SeV感染后qRT-PCR，显示SeV P mRNA增加，IFNB1、IFIT2、IFIT3降低而TNF（tumor necrosis factor）基本不变。结论：TRIM69选择性支持抗病毒基因表达。

讨论总结：讨论指出，TRIM69是IFN和病毒诱导因子，抑制AMPK信号、自噬相关反应并限制多种RNA/DNA病毒，同时支持抗病毒基因表达；其功能扩展了TRIM69作用谱，并建立其与AMPK通路的联系。与TDRD7研究一致，AMPK为促病毒信号节点，IFN系统可通过靶向宿主代谢通路限制感染。既往TRIM69可降解DENV NS3、抑制VSV转录、稳定微管等，本研究补充其靶向宿主AMPK通路。Kueck et al.未观察到SeV抑制，而本研究通过病毒蛋白、RNA和感染性颗粒等多个读出及内源敲低验证SeV表型；差异原因尚不清楚，可能反映细胞或病毒实验系统差异。TRIM69选择性降低IFNB1、IFIT2、IFIT3而不明显影响TNF，提示其可能支持IRF依赖的抗病毒转录程序而非全局炎症反应。原文指出：TRIM69抑制AMPK的分子机制未知，作为E3泛素连接酶可能通过泛素化依赖机制调控AMPK通路组分，也可能通过非经典支架或调控功能影响AMPK活性；AMPK抑制对整体抗病毒表型的相对贡献需遗传或药理救援实验确定；AMPK抑制是否为TRIM69抗病毒活性的一般特征或随病毒背景而异仍需确定。

研究结论部分翻译：总之，研究人员的发现确定TRIM69是一种广谱抗病毒ISG，其抑制AMPK信号和自噬相关反应，同时促进抗病毒基因表达。结合既往关于TRIM69和TDRD7的研究，这些结果支持如下模型：干扰素诱导的限制因子可通过靶向高效病毒复制所需的宿主代谢通路来限制感染。更广泛地说，这些发现强调以AMPK为中心的信号网络作为病毒容许性（viral permissiveness）调节因子的重要性，并提示TRIM69等可诱导宿主因子利用这些通路建立抗病毒细胞环境。