《iScience》：Deep protease profiling deconvolutes protease signatures released from activated neutrophils
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蛋白酶活性失调推动癌症、心血管疾病和炎性疾病进展。现有基于底物的检测方法缺乏特异性与广度，且需事先掌握蛋白酶组成信息。研究人员通过差异富集、底物基序与反卷积分析推进了深度蛋白酶谱分析技术，以实现对蛋白酶活性的全面、无偏、可规模化表征。研究人员以噬菌体文库筛选
蛋白酶活性失调推动癌症、心血管疾病和炎性疾病进展。现有基于底物的检测方法缺乏特异性与广度，且需事先掌握蛋白酶组成信息。研究人员通过差异富集、底物基序与反卷积分析推进了深度蛋白酶谱分析技术，以实现对蛋白酶活性的全面、无偏、可规模化表征。研究人员以噬菌体文库筛选中性粒细胞丝氨酸蛋白酶或活化中性粒细胞，并通过高通量测序鉴定被切割肽段。组织蛋白酶G、中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3（PR3）分别切割5,985、5,325和1,285条肽段，其底物识别基序与天然底物一致。活化中性粒细胞上清切割5,166条肽段，丝氨酸蛋白酶抑制导致信号减少95%。反卷积算法识别出弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和PR3的蛋白酶特征谱，其比例与中性粒细胞中相应蛋白酶水平一致。该方法可实现对蛋白水解的系统性功能分析，可跨蛋白酶、样本和场景适配，以推进疾病理解、诊断与管理。
## 论文解读文章
**一、研究背景与科学问题**
蛋白酶是脊椎动物体内最大的酶基因家族，约占人类基因组的3%，是健康生物系统的关键调控因子。蛋白水解受到表达分泌、激活和抑制等多层面的时空调控。蛋白酶活性失调是癌症、心血管疾病、神经退行性疾病和炎性疾病等多种疾病进展的重要驱动因素，因此全面、灵敏地评估蛋白酶活性有望为疾病的早期检测、分期和监测提供重要手段。然而，生物样本的复杂性给蛋白酶活性的准确检测带来了重大挑战。现有的基于显色底物或荧光底物的检测方法存在两方面主要局限：其一，它们需要预先知道待检测样本中存在的蛋白酶种类；其二，信号容易被具有广泛且重叠底物特异性的蛋白酶所掩盖。
目前可用的蛋白酶检测工具可在高通量水平上绘制单个蛋白酶的底物特异性，另一些方法则已用于鉴定蛋白酶的新型生物底物并定义复杂组织中的生物降解组。然而，这些方法受限于可用底物的多样性，难以适应蛋白酶检测平台的需求。例如，生理蛋白的切割取决于底物特性（如二级结构和表面环暴露程度），导致底物多样性较低；且天然底物浓度差异巨大，可能独立于氨基酸序列而影响切割程度。
深度蛋白酶谱分析通过将底物噬菌体展示与高通量测序相结合来解决上述局限，能够针对大规模底物多样性进行蛋白酶活性的定量表征。尽管深度蛋白酶谱分析已被应用于纯化的单一蛋白酶，但其作为高灵敏度检测工具在复杂生物混合物中的应用仍因反卷积重叠特异性带来的计算挑战而基本未被探索。为此，研究人员报道了一个由随机5-mer底物噬菌体展示文库组成、用于检测复杂生物混合物中蛋白酶活性的无偏且全面的深度蛋白酶谱分析平台，并通过解析活化中性粒细胞上清中单个蛋白酶的信号特征对该方法进行了验证。
**二、研究总体设计与核心发现**
研究人员构建了一个深度为2.1×10?独立克隆的M13底物噬菌体展示文库，该文库基于fUSE67载体，插入随机5个氨基酸肽段并带有N端FLAG标签。首先在纯化条件下评估了三种中性粒细胞丝氨酸蛋白酶——组织蛋白酶G、中性粒细胞弹性蛋白酶和人蛋白酶3（PR3）的底物特异性。研究发现这些蛋白酶分别切割了5,985、5,325和1,285条显著性差异肽段。通过DECIPHER软件进行无监督多序列比对，所得基序与这些蛋白酶已知的底物偏好一致：组织蛋白酶G在P1位点呈主导性F/Y基序，弹性蛋白酶呈V/I基序。随后，研究人员将平台应用于PMA刺激的活化中性粒细胞上清，在无抑制剂条件下鉴定出5,166条被切割的底物肽段。丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF处理导致切割肽段数量减少95%，证实丝氨酸蛋白酶是活化中性粒细胞释放的主要蛋白酶类别。通过将纯化蛋白酶数据集构建为参考矩阵，研究人员将CIBERSORTx和EPIC两种反卷积算法应用于混合样本。两种算法均成功量化了弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和PR3的活性，且其相对比例与已报道的中性粒细胞内蛋白酶水平相符。AEBSF处理后相应信号显著降低，外部阴性对照蛋白酶（ADAMTS13和凝血酶）信号未检出，验证了方法的特异性。
**三、关键技术与方法**
本研究涉及以下主要技术方法：（1）基于M13噬菌体展示的随机5-mer底物文库构建，文库深度为2.1×10?独立克隆，采用NNK简并密码子设计；（2）将纯化的中性粒细胞丝氨酸蛋白酶或PMA活化中性粒细胞上清与固定在抗FLAG琼脂糖珠上的噬菌体文库共孵育，释放被切割的噬菌体颗粒；（3）利用Illumina NextSeq2000平台进行高通量测序，通过PEAR软件组装读数，并经DESeq2进行差异富集分析以鉴定显著切割肽段；（4）采用DECIPHER进行无监督多序列比对推断切割位点，用IceLogo进行序列基序可视化；（5）运用CIBERSORTx和EPIC反卷积算法将混合样本中的切割肽段信号分解为单个蛋白酶的贡献比例。样本来源于6名健康成人捐献者（3男3女，年龄20-25岁）的外周血中性粒细胞。
**四、研究结果**
**1. 深度谱分析表征中性粒细胞丝氨酸蛋白酶的特异性。** 研究人员通过泊松距离热图和主成分分析确认了生物学重复间的低变异性。组织蛋白酶G、弹性蛋白酶和PR3分别切割5,985、5,325和1,285条肽段。PR3样本与无蛋白酶及FLAG洗脱对照聚集在一起，提示其蛋白水解活性较弱，与此前研究一致。DECIPHER无监督比对显示组织蛋白酶G的主导基序为P5-P4-(V/I)-(L/V/M)-(F/Y)-S-P2′-P3′-P4′，弹性蛋白酶基序为P5-P4-P3-(L/F)-(V/I)-(S/W)-P2′-P3′-P4′，PR3基序虽欠明确定义但呈现(Y/F)-(L/V/I/F)-(W/F)偏好，均与已知底物特异性相符。
**2. 深度谱分析识别活化中性粒细胞释放的蛋白水解活性信号。** 无监督层次聚类显示各处理条件内部具有强一致性，主成分分析将无抑制剂和EDTA处理的上清与AEBSF、AEBSF+EDTA及对照样本明显分离。活化中性粒细胞上清切割了5,166条肽段，EDTA组为5,190条，AEBSF组降至558条，联合抑制组为313条。AEBSF抑制使切割信号减少95%，表明检测到的切割活性主要来自丝氨酸蛋白酶。上清的基序特征与弹性蛋白酶高度相似，且65%的切割肽段与纯化蛋白酶底物重叠。
**3. 反卷积分析以高一致性定量生物样本中的蛋白酶活性。** 基于MEROPS数据库的参考底物无法鉴定中性粒细胞样本中的蛋白酶特征，而基于深度谱分析构建的参考矩阵则成功实现了反卷积。CIBERSORTx显示弹性蛋白酶活性占比在无抑制剂和EDTA组分别为51.6%和50.6%，在AEBSF和AEBSF/EDTA组降至2.3%和3.5%；组织蛋白酶G相应地从3.1%/2.8%降至0.2%/0.4%。EPIC分析得到高度相似的结果。阴性对照ADAMTS13和凝血酶的信号在所有样本中均未检出。
**五、讨论与结论**
本研究相较于传统底物噬菌体展示的关键进展在于将其与计算反卷积结合，无需依赖先验底物知识或已开发的探针即可在蛋白酶混合物数据和单个蛋白酶数据之间建立推断关系。与定量蛋白酶丰度的蛋白质组学方法相比，本方法提供的是功能性读数，可反映翻译后修饰、基因变异或抑制剂调节引起的活性变化。与质谱多底物谱分析（MSP-MS）相比，噬菌体文库的底物覆盖范围（约10?肽段）显著更大，且所需资源更少。研究证实弹性蛋白酶活性明显高于组织蛋白酶G，范围在7.6倍至17.4倍之间。值得注意的是，本研究首次通过全面且无偏的噬菌体文库方法在复杂生物混合物中量化并反卷积了单个中性粒细胞丝氨酸蛋白酶的活性，代表了从针对单一探针或肽段的活性检测向评估整个蛋白水解景观的广谱底物活性检测的转变。研究结论表明，深度蛋白酶谱分析结合反卷积算法，能够在复杂生物混合物中准确鉴定和定量单个蛋白酶的活性信号，为疾病理解、诊断和管理提供了一个可推广的系统性功能分析平台。
