基于结构模型的Polyomavirus T抗原J-结构域在病毒DNA复制过程中调控p53结合的机制研究

《Viruses》：Structure Based Models Suggest That J-Domains Within Polyomavirus T-Antigens Help Regulate p53 Binding During Viral DNA Replication

　　

由多瘤病毒（Polyomaviruses，PyV）编码的T抗原（T-ags）在病毒DNA复制过程中发挥多种作用。然而，关于T-ag在DNA复制不同阶段的功能及其调控机制仍存在相当大的不确定性。例如，细胞周期依赖性的单个苏氨酸残基磷酸化如何调控PyV DNA复制尚未阐明，N端J-结构域（J-domain）在体内DNA复制中的作用尚不明确，以及p53如何从T-ag表面被置换也未得到清晰解释。这些问题未能解决的部分原因在于以往的结构研究多采用T-ag的独立结构域而非全长T-ag分子。因此，研究人员利用AlphaFold3对全长SV40 T-ag在包含模型DNA复制叉、辅因子以及Thr124磷酸化条件下的结构进行了建模。这些建模研究表明，细胞周期依赖性T-ag残基Thr124的磷酸化稳定了一种构象，其中J-结构域位于解旋酶结构域（helicase domain）上方。在此位置上，J-结构域残基与构成p53结合位点的解旋酶结构域残基形成了多重键合。因此，提出SV40 J-结构域（连同hsc70）可能在将p53从T-ag表面置换的过程中发挥作用，这一过程可能有助于聚合酶α-引物酶复合体（polymerase α-primase complex）的招募以及随后的病毒DNA复制起始。

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研究背景与现存问题

多瘤病毒（Polyomaviruses, PyV）是一类含有环状双链DNA基因组的病毒，可导致多种人类疾病，如JC病毒引起进行性多灶性白质脑病，BK病毒与肾病和出血性膀胱炎相关，而MC病毒则引发默克尔细胞癌。所有PyV均表达一种早期蛋白——大T抗原（large T-antigen, T-ag），该蛋白在病毒DNA复制和细胞转化中发挥多重作用。T-ag包含多个结构域：N端的J-结构域（J-domain）、邻近的起源结合结构域（Origin Binding Domain, OBD）以及C端的锌指/解旋酶结构域（Zn/helicase domain）。尽管已有大量研究，但仍有几个关键问题未获解答：首先，细胞周期依赖性磷酸化单个苏氨酸残基（SV40 T-ag的Thr¹²⁴）如何调控PyV DNA复制的分子机制尚不清楚；其次，N端J-结构域在体内DNA复制中的具体功能未被阐明；此外，p53如何从T-ag表面被有效置换的机制也缺乏解释。这些问题的悬而未决，部分原因是以往的结构研究多集中于T-ag的独立结构域，而非全长T-ag分子在生理相关条件下的整体构象。

研究目的与意义

为解决上述关键问题，本研究的主要目标是利用AlphaFold3进行分子建模研究，模拟全长SV40 T-ag在结合叉状DNA结构以及关键辅因子（包括细胞周期依赖性Thr¹²⁴磷酸化）条件下的三维结构。研究结果表明，Thr¹²⁴的磷酸化能够稳定一种特定构象，使N端J-结构域定位至解旋酶结构域上方，并与构成p53结合位点的多种残基发生相互作用。这一发现揭示了Thr¹²⁴磷酸化和J-结构域依赖性的p53结合调控机制，为理解PyV T-ags在病毒DNA复制过程中的精确调控提供了重要的结构基础，并提出了J-结构域/hsc70复合物在p53置换中的新功能假说。

关键技术方法

本研究主要采用的计算方法为AlphaFold3蛋白质结构预测程序，用于对全长SV40 T-ag六聚体在叉状DNA模板上的组装结构进行建模。研究中使用了特定的寡核苷酸序列形成模型复制叉，并在建模过程中加入了关键的辅因子，包括六个ATP分子、六个Mg⁺⁺和Zn⁺⁺离子，以及Thr¹²⁴的磷酸化修饰。结构可视化与分析借助了PyMol和Chimera X分子图形软件，并通过PDBsum程序分析了N端与解旋酶结构域之间的残基相互作用。此外，利用Clustal Omega程序对SV40 T-ag与代表性人类致病性PyV T-ags的氨基酸序列进行了比对分析。

研究结果

3.1 最小T-ag片段（T-ag_131-616）六聚体的AlphaFold3模型

研究人员利用AlphaFold3构建了T-ag_131-616片段在叉状DNA底物上的六聚体结构模型。该模型证实，T-ag的OBD结构域靠近复制叉，且其结构与先前实验确定的T-ag_131-627片段在起始DNA上形成的结构高度相似。

3.2 不支持SV40 DNA复制条件下全长T-ag的AlphaFold3模型

在无辅因子的apo状态下，以及在不同组合的ATP、Mg⁺⁺和Zn⁺⁺存在下，AlphaFold3预测的全长T-ag六聚体呈现出多种构象，J-结构域可位于OBD的N端、Zn区域上方或解旋酶结构域上方等不同位置。这表明在这些条件下，J-结构域是动态变化的，并未固定在单一位置。

3.3 Thr¹²⁴磷酸化促进J-结构域与解旋酶结构域相互作用的构象稳定

在加入Thr¹²⁴磷酸化修饰后，AlphaFold3计算收敛于一个唯一的、与种子数无关的结构，其中J-结构域与解旋酶结构域发生相互作用。进一步分析显示，磷酸化的Thr¹²⁴与相邻单体中的Met³⁰¹（紧邻Zn基序起始点Cys³⁰²）并列，可能起到稳定六聚体的作用。静电分析表明，磷酸化导致Thr¹²⁴周围的拱形结构塌陷，使其移至靠近Zn结构域的区域并与Met³⁰¹相邻。PDBsum分析揭示，J-结构域残基与构成p53结合位点的解旋酶结构域残基之间形成了氢键、非键接触和盐桥等多种相互作用，同时还与p68亚基（聚合酶α-引物酶复合体的调节亚基）结合位点以及LXCXE基序的残基发生了相互作用。

3.4 J-结构域可能调控p53与Pol α-引物酶复合体在T-ag上的竞争性结合

研究发现，当J-结构域结合到p53结合位点时，构成p68亚基结合位点的一部分残基（如Lys⁴²⁵、Lys⁵⁵⁰、His³⁹⁵和Cys³⁹⁶）仍然暴露，可能为聚合酶α-引物酶复合体的初始结合提供成核位点。但由于J-结构域也与p68结合位点残基有广泛接触，因此在完全招募p68之前，J-结构域需要被置换。

3.5 C端截短和点突变T-ag的预测结构

对C端缺失38个氨基酸的T-ag_1-670片段进行建模，发现其仍保留了Thr¹²⁴磷酸化相关的J-结构域向解旋酶结构域的重新定位特征，这与该截短不影响DNA复制的观察一致。对于已知破坏J-结构域与hsc70相互作用的P43F突变体，其在Thr¹²⁴磷酸化条件下同样形成了J-结构域位于解旋酶结构域上方的唯一结构，与野生型相似。

讨论与结论

本研究的AlphaFold3建模结果表明，在叉状DNA底物上，SV40 T-ag的J-结构域会向C端移动，并且这种移动受Thr¹²⁴磷酸化的稳定。这一发现与早期部分蛋白水解和免疫共沉淀研究提出的N端结构域与中央区域稳定关联的观点一致。基于此，研究人员提出了一个细胞周期依赖性的J-结构域/hsc70复合物与Rb和p53相互作用的模型：在G1晚期，J-结构域/hsc70复合物靶向结合于LXCXE基序上的Rb/E2F复合物，释放E2F从而上调S期基因；进入S期后，Thr¹²⁴被磷酸化，导致J-结构域稳定结合于解旋酶结构域表面的p53结合位点，随后J-结构域/hsc70复合物促进p53从T-ag上被置换。一旦J-结构域和LXCXE基序对接至解旋酶结构域，将阻止额外的p53和Rb分子与T-ag结合，起到屏蔽作用。此外，p53的移除可能有助于聚合酶α-引物酶复合体在其邻近位点上的结合，进而启动RNA/DNA引物的合成。序列比对显示，多种临床相关的人类PyV T-ags均含有J-结构域、LXCXE基序、Thr¹²⁴类似残基以及p53和pol α-引物酶的结合位点，表明该调控模型具有广泛的适用性。

研究结论：本研究表明，细胞周期依赖性的Thr¹²⁴磷酸化稳定了SV40 T-ag的一种构象，使J-结构域定位于解旋酶结构域之上，并与p53结合位点残基形成多重相互作用。据此提出，J-结构域/hsc70复合物在体内具有第二个关键作用，即细胞周期依赖性地将p53从T-ag表面置换，这一过程可能使聚合酶α-引物酶复合体得以招募，从而启动病毒DNA复制。