《Viruses》：Development of an Oligoprobe-Based Targeted High-Throughput Sequencing Method for Grapevine Virus Detection
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本研究旨在开发并评估一种靶向高通量测序（high-throughput sequencing, HTS）策略，利用定制设计的寡探针面板增强葡萄藤相关病毒的检测。设计AmpliSeq Custom DNA寡探针面板，靶向侵染葡萄藤的24种RNA病毒和6种DNA病
本研究旨在开发并评估一种靶向高通量测序（high-throughput sequencing, HTS）策略，利用定制设计的寡探针面板增强葡萄藤相关病毒的检测。设计AmpliSeq Custom DNA寡探针面板，靶向侵染葡萄藤的24种RNA病毒和6种DNA病毒，以结构性及非结构性病毒基因作为感兴趣区域（regions of interest, ROIs）。研究比较四种基于HTS的方法：两种基于寡探针的方法（oligoprobe method, OM），即寡探针法-总RNA（OM-TR）和寡探针法-双链RNA（OM-DR）；两种非寡探针方法（non-oligoprobe method, NOM），即非寡探针法-总RNA（NOM-TR）和非寡探针法-双链RNA（NOM-DR）。其中，OM-TR和OM-DR表现出增强的病毒检测能力，提供更大的病毒多样性并改善病毒读取强度（read intensity, RI）值。使用Virtool v8应用进行HTS数据管理和病毒序列分析。OM-DR在七株病毒感染葡萄藤中检测到七种病毒，OM-TR检测到六种。OM-DR检测到的病毒包括Grapevine leafroll-associated virus（GLRaV）-1、-2、-3、Grapevine rupestris stem pitting-associated virus（GRSPaV）、Grapevine Pinot gris virus（GPGV）、Grapevine virus H（GVH）和Grapevine red blotch virus（GRBV）。基于寡探针的方法较非寡探针方法增强了病毒检测。OM方法改善了葡萄藤病毒检测，可作为敏感且可扩展的葡萄藤病毒诊断工具进行测试，为加拿大检疫计划和葡萄藤繁殖材料国内认证提供有价值支持。
葡萄藤病毒病是全球葡萄生产的重要威胁，可造成显著经济损失和贸易限制，因此准确判定葡萄藤繁殖材料的植物检疫状态对国内认证和国际移动均至关重要。高通量测序（high-throughput sequencing, HTS）虽已用于病毒检测和发现，但宿主核酸丰度高会降低低滴度病毒检测灵敏度，故需采用靶向富集、定制DNA或RNA探针等策略提高检测能力。基于此，研究人员开发并评估了定制DNA寡探针面板结合HTS的靶向测序策略，比较寡探针法（oligoprobe method, OM）与非寡探针法（non-oligoprobe method, NOM）在总RNA和双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）底物上的检测效果，以期 simultaneausly 检测多种葡萄藤RNA和DNA病毒，并服务于加拿大检疫计划和繁殖材料认证。该研究结论表明OM-DR和OM-TR总体检测灵敏度较高，OM-TR产生较高病毒特异性读取强度，定制寡探针面板可同时检测多种重要葡萄藤病毒，Virtool分析可降低宿主序列干扰并促进混合感染分析；同时，靶向富集对部分变异株可能漏检，提示靶向与无靶向HTS应互补使用。
关键技术方法（≤250字）：研究共纳入九份样本，包括七份病毒感染葡萄藤、一份无病毒葡萄藤和一份Tomato brown rugose fruit virus（ToBRFV）感染的番茄非宿主阳性对照；健康与感染葡萄藤样本分别保存于Brock University的phytotron设施。研究人员提取总RNA和dsRNA，进行cDNA合成及定制DNA寡探针面板扩增，制备文库，使用Illumina NextSeq 2000进行150 bp双端测序，并以Virtool v8进行HTS数据质控、病毒序列分析和鉴定；同时比较OM-TR、OM-DR、NOM-TR和NOM-DR四种流程，并以常规终点PCR和RT-PCR辅助比较检测特异性与灵敏度。
研究结果如下。3.1 检测到的病毒：通过四种HTS流程比较七份感染葡萄藤样本，OM-DR检测到的病毒数量最多，OM-TR次之；OM-DR在七株病毒感染葡萄藤中检测到七种病毒，OM-TR检测到六种。研究共在感染样本中检测到GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GRSPaV、GPGV、GVH、GVE、GRBV、GRGV和GEV-1等十种病毒。OM-DR在PN和REI中分别检出七种病毒，为四种流程中最高；OM-TR在PN和REI中分别检出五种和四种；OM-DR在CHA、NYM、PG和GN中各检出六种，OM-TR在GN中检出六种、在MER中检出五种。NOM-DR和NOM-TR对部分卷叶相关病毒的检测灵敏度低于OM-DR和OM-TR；NOM-DR和NOM-TR在REI和GN中检出未列入寡探针面板的GRGV。常规PCR可检出GRBV，RT-PCR检出的RNA病毒少于OM方法，说明OM-DR较其余流程增强了病毒检测。ToBRFV在所有四种流程中均被检出，表明文库制备和HTS运行成功。3.2 HTS数据与Virtool分析：HTS运行总体Q20质量良好；分析时扣除宿主葡萄基因组序列，总读取数在不同样本和方法间为100至6,000,000条，病毒序列比对读取占总体读取的0.1%至25%。OM-TR和NOM-TR的总体比对读取比例高于OM-DR和NOM-DR；ToBRFV基因组在所有HTS流程中覆盖度为99.9%至100%，weight为0.2至0.4。3.3 读取强度（read intensity, RI）值：OM-DR和OM-TR经Virtool分析显示对应两个感兴趣区域（regions of interest, ROIs）的两个峰，单峰或多于两峰的样本被排除；在dsRNA为病毒核酸来源的HTS中，病毒序列读取数>20视为阳性。PN样本病毒数量最多，OM-DR检出七种病毒（GLRaV-1、-2、-3、GRBV、GRSPaV、GPGV和GVH），OM-TR检出五种（GLRaV-2、-3、GRBV、GRSPaV和GPGV），NOM-DR检出三种（GLRaV-3、GRSPaV和GPGV），NOM-TR检出两种（GLRaV-3和GEV-1）。OM-DR的RI范围为0至400,000，OM-TR为0至1.3百万，NOM-DR为0至2000；OM-DR和OM-TR中ROI病毒序列总覆盖度反映寡探针覆盖的平均核苷酸长度，检测病毒的总体覆盖度为全基因组的2.0%至15%。
讨论部分总结：HTS易受宿主核酸背景影响，靶向扩增和探针富集可提高低滴度病毒检测灵敏度；本研究中OM-DR显示较高检测灵敏度，OM-TR产生较高病毒特异性读取强度，说明检测灵敏度与序列丰度是HTS性能的不同指标。Virtool应用可减少宿主序列干扰并简化复杂数据集和混合感染分析。检测到的病毒多为非调控但具商业重要性的病毒，涉及卷叶病、红斑病及潜伏或无症感染；其中GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GRSPaV、GPGV和GRBV属于加拿大葡萄藤认证网络（Canadian Grapevine Certification Network, CGCN）认证计划G3阶段强制检测的关切病毒。GVE仅由NOM-TR和NOM-DR检出，而OM-TR、OM-DR和RT-PCR未检出，提示靶向富集可能因寡探针对病毒株或 divergent variants 代表性不足而漏检，靶向富集与无靶向宏基因组HTS应作为互补策略。靶向寡探针HTS适用于病毒清单预先确定的常规筛查，无靶向HTS仍适用于全面病毒组表征和新病毒发现。
研究结论翻译：本研究证明，靶向寡探针富集结合HTS可用于同时检测和表征侵染葡萄藤的多种病毒。比较基于寡探针和非寡探针方法并使用总RNA和dsRNA表明，核酸底物选择和富集策略会显著影响病毒检测和序列回收。在所评估的流程中，OM-DR和OM-TR提供最高的总体病毒检测灵敏度，其中OM-TR产生相对较高的病毒特异性读取强度，表明检测灵敏度和序列丰度代表HTS性能的不同度量。定制寡探针面板可同时检测多种经济重要葡萄藤病毒，包括Grapevine leafroll-associated virus 1（GLRaV-1）、GLRaV-2、GLRaV-3、Grapevine rupestris stem pitting-associated virus（GRSPaV）、Grapevine Pinot gris virus（GPGV）和Grapevine red blotch virus（GRBV）。将HTS数据集与Virtool生物信息学平台整合，可通过减少宿主来源序列干扰、促进复杂数据集和混合感染分析来进一步支持病毒鉴定。重要的是，非寡探针方法检测到Grapevine virus E（GVE），而OM-TR、OM-DR或RT-PCR未检测到，这突显了靶向富集的固有局限，可能源于寡探针对病毒株或 divergent variants 的非特异性或代表性不足，使其逃逸检测；因此，靶向富集和无靶向宏基因组HTS应被视为潜在互补方法。总体而言，当关切病毒预先确定时，寡探针辅助HTS为葡萄藤繁殖材料常规筛查提供了敏感、可扩展且具成本效益的策略；相比之下，无靶向HTS在全面病毒组表征及新病毒或高度 divergent 病毒发现中仍具重要作用。定期应用无靶向测序可补充靶向面板，并提供更新探针设计所需的序列信息，以应对葡萄藤病毒多样性演化。研究结果对葡萄藤认证、清洁植物计划、监测和加拿大繁殖材料国内移动具有实际意义。纳入经过适当验证的靶向HTS方法可在单次检测中同时筛查多种病毒，并产生可用于病毒表征的序列信息。经进一步分析验证、包容性和排他性评估，并在更广泛品种、病毒分离株、地理区域和病毒滴度中评价后，该方法可促进稳健的HTS葡萄藤健康管理诊断框架开发。更广泛而言，可适应的探针面板结合标准化生物信息学流程，可为多年生作物认证体系应对不断变化的植物检疫要求和新兴病毒威胁提供灵活平台。
