超越间充质干细胞范式：迈向分泌组研究的统一概念、方法与跨物种应用

《Biology》：Beyond the MSC Paradigm: Toward Unified Concepts, Methods and Applications in Secretome Research

　　

摘要专业翻译 分泌组（secretome）已从一个以蛋白质为中心的概念，演变为一个动态的多维通信系统，涵盖可溶性蛋白、细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）、代谢物、脂质、核酸及其他生物活性组分。尽管分泌组研究取得了重大进展，该领域在生物系统间仍呈碎片化状态，且尤其以间充质基质/干细胞（mesenchymal stromal/stem cells, MSCs）研究为主导。本综述提供了跨越哺乳动物、植物、真菌和细菌系统的分泌组生物学统一视角。研究人员审视了分泌组定义的演变、经典与非经典分泌途径，以及新兴分析方法，包括质谱（mass spectrometry）、代谢标记、单细胞和空间分泌组学、多组学整合及人工智能。研究人员进一步讨论了在生物标志物发现、液体活检、再生医学、癌症生物学、生物技术和无细胞治疗中的应用，以及当前在标准化、可重复性、生产和临床转化方面的挑战。超越以MSC为中心的框架，向组织、细胞类型和生物体分辨的分泌组图谱迈进，可能有助于构建更全面的通信图谱，并支持预测性生物标志物、精准治疗和合理设计的基于分泌组的产品开发。

论文主体内容总结

1. 引言

分泌组概念最初由Tjalsma等人于2000年在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）基因组分析中提出，指分泌蛋白及其导出机制。随后定义扩展至细胞外囊泡（EVs）、脂质、核酸及其他纳米结构组分，凸显细胞通信通过复杂的多组分纳米结构分泌组发生。过去二十年间，分泌组研究在质谱蛋白质组学、代谢标记及无细胞治疗兴趣推动下显著扩展，但文献主要聚焦于间充质基质/干细胞（MSCs）的分泌组。MSC范式主导存在若干局限：MSC分泌组因供体变异、组织来源、培养条件、传代次数及预处理策略而呈现显著分子与功能异质性，影响可重复性和效力评估；过度聚焦MSC可能掩盖其他哺乳动物细胞类型及植物、真菌、细菌中重要的分泌组生物学；MSC和癌症研究开发的方法未必直接适用于其他领域。文献计量分析显示，全球分泌组研究呈指数增长，2006年年度发文不足50篇，2025年超过2000篇；2022至2026年间研究明显转向多组学、单细胞工作流、非MSC谱系及跨物种比较生物学。

2. 分泌组概念的演变与定义

分泌组概念经历了从细胞机器到细胞外产物的历史轨迹。经典分泌在真核细胞中依赖N端信号肽将新生多肽靶向内质网（ER），经COPII包被囊泡运输至高尔基体加工分选，最终通过胞吐释放。非经典蛋白分泌（UPS）包括绕过ER-高尔基途径的多种机制：质膜直接易位、ABC转运体介导的导出、内涵体或多囊体衍生囊泡整合、分泌性自噬中间体释放，以及质膜来源微囊泡释放。在植物中，无信号肽分泌蛋白可能占实验检测分泌组的一半以上。细菌缺乏内质网和高尔基体，经典分泌依赖Sec和Tat途径。纳米结构分泌组框架包含可溶性蛋白、细胞外囊泡（外泌体30–150 nm、微囊泡100–1000 nm、凋亡小体）及非膜性纳米颗粒（脂蛋白、外泌体样颗粒exomeres、supermeres）。外泌体经内涵体系统生成，依赖ESCRT机制或非ESCRT途径；微囊泡通过质膜直接出芽形成。分泌组还与多个重叠"组学"交叉，包括基质组（matrisome）、黏附组（adhesome）、受体组（receptorome）和循环组（circulome）。

3. 分析与计算方法：迈向统一方法

样本制备面临共同及系统特异的技术挑战。哺乳动物细胞培养模型的主要障碍包括细胞死亡或裂解导致的胞内蛋白污染、血清蛋白宽动态范围及分泌蛋白稀释。植物系统因刚性细胞壁和高比例无信号肽蛋白而面临额外挑战；微生物和真菌分泌组涉及细胞壁降解酶活性、复杂培养基及区分主动分泌效应蛋白与被动释放蛋白的需求。分离富集策略包括三氯乙酸（TCA）或丙酮沉淀、超滤、SP3方案及差速超速离心和尺寸排阻色谱。质谱（MS）仍是无偏分泌组分析的基础，数据非依赖采集（DIA）增强可重复性和定量能力。代谢标记方法特别是生物正交非天然氨基酸标记（BONCAT）结合点击化学可实现新合成蛋白的选择性富集。邻近生物素化策略（TurboID、BioID、APEX）支持体内或共培养标记，实现复杂多细胞系统中分泌组的细胞来源解析。单细胞分泌组学通过微流控、液滴平台及质谱兼容工作流实现单细胞水平分泌蛋白谱分析。数据标准化方面，PlantSecKB、MetazSecKB、Human Protein Atlas及分泌蛋白数据库（SEPDB）等资源支持分泌组注释和预测；深度学习框架如DeepSecE整合蛋白语言模型特征与transformer模块，实现跨系统的多类分泌信号解析。

4. 跨系统分泌组生物学

哺乳动物细胞持续释放可溶性因子、EVs及其他纳米结构组分。癌细胞分泌组影响肿瘤发生的几乎所有阶段，包括局部侵袭、基质重编程、转移前微环境形成和治疗耐药。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、髓系来源抑制细胞和调节性T细胞共同构成肿瘤微环境（TME）的局部分泌组。内皮细胞分泌组调节血管张力、生理性血管生成和局部炎症；成纤维细胞和肌成纤维细胞分泌细胞外基质组分、基质金属蛋白酶和信号因子。干细胞分泌组方面，MSC分泌组具有免疫调节、抗炎、促血管生成、抗凋亡和抗纤维化活性，其组成受组织来源、培养条件和预处理策略调节。诱导多能干细胞（iPSC）来源的MSC分泌组在可扩展性和供体变异方面具有优势。细菌病原体依赖I至IX型分泌系统输出毒力因子，其中I、III、IV、VI型为一步系统形成跨膜通道，II、V、IX型为两步系统依赖Sec或Tat转位酶。革兰氏阴性菌通过外膜囊泡（OMVs）实现移动运输。丝状真菌是生物圈中最高产的分泌者之一，分泌组以碳水化合物活性酶（CAZymes）、蛋白酶、脂肪酶和次级代谢物为主。里氏木霉（Trichoderma reesei）在纤维素降解产物触发下上调并分泌大量纤维二糖水解酶和葡聚糖内切酶。植物细胞将分泌产物释放至质外体，经典分泌经ER-高尔基途径递送细胞壁蛋白、酶和信号肽；无信号肽蛋白在植物分泌组中占比高，但早期估算可能因细胞质污染而被高估。病原攻击时植物快速重编程分泌组输出，分泌病程相关（PR）蛋白、蛋白酶、几丁质酶和抗微生物肽；植物EVs通过跨物种RNA干扰（RNAi）将宿主小RNA递送至入侵真菌细胞。根系分泌物塑造根际微生物组、动员土壤养分并促进共生互作。跨系统比较显示，经典与非经典分泌途径、细胞外囊泡作为货物载体以及分泌组的可塑性是保守的核心机制；细菌分泌系统的多样性、真菌的高分泌能力及植物的质外体定向分泌是系统特异性创新。

5. 应用与转化格局

诊断与生物标志物方面，循环分泌组提供实时微创的组织生理病理窗口。肿瘤来源EVs携带细胞来源的分子指纹，支持早期检测、诊断、预后和治疗监测。非肿瘤领域正在探索神经退行性疾病、心血管疾病、慢性炎症和代谢紊乱的分泌组来源生物标志物。无细胞治疗方面，干细胞移植的治疗获益主要归因于旁分泌因子，推动了基于条件培养基或纯化EV组分的无细胞策略。MSC来源分泌组和EVs在伤口愈合、心肌梗死、缺血性卒中、骨关节炎等临床前模型中显示组织修复和炎症调节效果。预处理策略如低氧、炎症因子、3D培养可增强生物活性。抗癌潜力方面，分泌组生物活性具有高度情境依赖性：肿瘤细胞、癌症相关成纤维细胞（CAFs）和髓系来源抑制细胞的分泌程序可促进恶性进展；而经分子预处理的MSC分泌组在特定临床前模型中显示抗肿瘤活性。影响生物活性的变量包括细胞来源、培养条件、生物物理组分（EVs vs. 可溶性蛋白组）、肿瘤模型和给药方案。一项21项临床报告的系统综述显示EV治疗总体安全，严重不良事件率0.7%，不良事件率4.4%。工业与农业应用方面，真菌分泌组学加速了新型酶发现和工程分泌菌株开发；根系分泌物和植物来源EVs被探索为生物刺激素和作物保护剂。标准化与GMP生产方面，定义关键质量属性（CQAs）如身份、纯度、效力、安全性和稳定性比单一分子产品更具挑战性。当前MSC来源EV的GMP工作流使用中空纤维生物反应器，下游纯化涉及切向流过滤（TFF）和尺寸排阻色谱（SEC）。监管分类因司法管辖区而异：美国FDA将天然哺乳动物细胞条件培养基和分离EV治疗产品归类为人体细胞、组织及细胞组织产品（HCT/Ps），需完整研究性新药（IND）批准；欧洲药品管理局（EMA）通常将其归入先进治疗 medicinal 产品（ATMP）框架或生物药品框架。

6. 新兴前沿与未来方向

工程化与预处理分泌组方面，预处理策略如低氧、炎症因子、3D培养和药理制剂可改变分泌组组成；基因和分子工程方法可过表达治疗蛋白、富集特定miRNA或展示靶向配体。体内分泌组图谱方面，邻近生物素化与组织选择性表达系统结合可实现循环蛋白的细胞来源解析。果蝇多组学分泌组图谱通过组织特异性TurboID标记定义了535种循环蛋白，证实了组织间运输现象。单细胞和空间分泌组学方面，ELISPOT、FluoroSpot、微刻印和纳米孔阵列实现单细胞分泌异质性评估；质谱兼容工作流结合代谢标记和点击化学实现单细胞分泌蛋白组覆盖；SEC-seq将转录状态与功能分泌关联；等离子体微孔阵列实现实时无标记分泌动态监测。AI驱动建模与多组学整合方面，Transformer基础模型如scGPT可生成基因和细胞嵌入表示，支持细胞类型注释、多组学整合和基因网络推断；变分自编码器（VAEs）如SpaOmicsVAE结合图神经网络和注意力机制实现空间多组学数据联合分析。