天祝白牦牛毛囊生长期与休止期皮肤H3K27ac全基因组图谱及阶段特异性超级增强子与转录调控解析

《Biology》：Genome-Wide Profiling of H3K27ac in Tianzhu White Yak Skin at the Anagen and Telogen Stages

　　

天祝白牦牛原产于中国甘肃省，以其白色被毛和纤维性状而受重视。其毛囊经历显著的季节性周期，但相关表观基因组调控仍知之甚少。研究人员利用切割靶向与转座（Cleavage Under Targets and Tagmentation, CUT&Tag）对生长期和休止期采集的皮肤样本进行组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（H3K27ac）分析，并将这些数据与RNA测序（RNA-seq）整合。研究人员鉴定出14,496个差异富集区域（differentially enriched regions），其中生长期H3K27ac富集增加的区域5,618个、减少的区域8,878个。相关基因富集于调控毛囊激活、上皮重塑和组织稳态的通路，包括Wnt、PI3K-AKT、MAPK和TGF-beta信号通路。生长期特异性超级增强子（super-enhancers, SEs）的推定靶基因富集于PI3K-AKT和Notch通路。基序分析显示，与毛囊生物学相关的转录因子结合基序富集，包括LEF1、LHX2、FOXN1和GATA3，而FOSL2和FOS::JUNB基序在生长期获得区域优先富集。CUT&Tag与RNA-seq整合分析鉴定出765个基因，其H3K27ac富集与转录本丰度在生长期和休止期之间呈一致变化，包括候选毛囊调控因子如FGF5、PDGFRA、TCF7和SMAD7。这些发现表征了阶段相关调控景观，并鉴定了可能参与毛周期和纤维性状的候选调控元件和基因。

研究背景与问题：天祝白牦牛主要分布于中国甘肃省天祝藏族自治县，是兼具肉用和纤维生产价值的地方品种，以均匀白色被毛为特征，其纤维由粗毛和细绒组成，毛囊（hair follicles, HFs）分为产生粗毛的初级毛囊和产生细绒的次级毛囊。毛囊经历生长期、退行期和休止期的季节性周期，直接决定纤维生长、产量和品质。已有研究提示Wnt/β-catenin、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF）、SHH、BMP和Notch等通路参与毛囊周期调控，但天祝白牦牛毛囊周期中生长期与休止期之间H3K27ac修饰的全基因组动态及其与转录调控的关系尚不清楚。H3K27ac是活跃启动子和增强子的表观遗传标志，超级增强子（super-enhancers, SEs）为高密度增强子簇，相关研究在牦牛毛囊周期中尚未开展。因此，研究人员以天祝白牦牛生长期和休止期皮肤为对象，解析H3K27ac调控景观并整合转录组，以识别参与毛囊周期和纤维性状的候选调控元件与基因。

关键技术与方法：研究人员从甘肃天祝县当地农户选取6只健康3岁雌性天祝白牦牛，生长期和休止期各3只不同个体，采集右侧肩胛部皮肤活检；采用CUT&Tag检测全基因组H3K27ac，RNA-seq检测转录组；使用MACS2进行峰识别，DiffBind/DESeq2鉴定差异富集峰，ChIPseeker注释，AME进行基序富集，ROSE鉴定SEs，DAVID进行GO/KEGG富集，并以Kruskal–Wallis检验、Fisher精确检验等整合CUT&Tag与RNA-seq数据。

研究结果：3.1 牦牛皮肤H3K27ac CUT&Tag图谱的质量评估与全基因组特征：通过对生长期和休止期各3份皮肤样本进行H3K27ac CUT&Tag测序，研究人员获得平均11.64 Gb原始数据，clean reads保留率超过99.00%，Q20和Q30分别为98.71%–99.58%和92.86%–97.30%，比对率96.32%–96.66%，峰内reads比例（fraction of reads in peaks, FRiP）为0.23–0.48；H3K27ac信号在转录起始位点（transcription start site, TSS）附近富集并向基因体递减，平均每样本104,069个峰，合并后分布于多数常染色体，主成分分析（principal component analysis, PCA）和相关性热图显示组内重复相似性高；峰主要位于远端基因间区、内含子和启动子。结论是该数据集质量可靠，可用于下游分析。

3.2 差异H3K27ac富集与牦牛皮肤阶段特异性调控程序相关：通过比较生长期与休止期全基因组H3K27ac，研究人员鉴定14,496个差异富集峰，其中生长期H3K27ac获得峰（H3K27ac-gain peaks）5,618个、H3K27ac丢失峰（H3K27ac-loss peaks）8,878个；获得峰偏好内含子（41.12%）和远端基因间区（31.93%），丢失峰远端基因间区（56.78%）和内含子（34.04%）比例较高。将峰关联至100 Kb内最近TSS，共关联6,873个基因。获得峰相关基因富集于毛囊激活和细胞增殖相关生物学过程，如干细胞增殖、皮肤屏障建立、细胞分裂和表皮生长因子受体信号，以及Hippo、cadherin、Wnt、MAPK、PI3K-AKT和TGF-beta通路；丢失峰相关基因富集于细胞外基质（extracellular matrix, ECM）组织、负调控细胞增殖、细胞黏附和负调控成纤维细胞生长因子受体信号，以及focal adhesion、ECM–receptor、JAK–STAT、Hedgehog、calcium、FoxO和AMPK通路。基序分析显示获得峰和丢失峰共享MSX1、MSX2、LEF1、TCF7L2、TCF7、TCF3、FOXN1、FOXC1、FOXD1、BATF::JUN、JUN::JUNB、FOS::JUNB、FOS、FOSL1、FOSL2、LHX2和NFATC1等基序，FOSL2和FOS::JUNB在获得峰中特异富集，提示AP-1介导的转录调控可能参与休止期向生长期转变及毛囊再生相关调控元件激活。

3.3 生长期和休止期皮肤H3K27ac相关超级增强子的全基因组鉴定：通过ROSE算法对H3K27ac信号排序，研究人员鉴定生长期1,119个SEs、休止期1,074个SEs，其中生长期特异310个、休止期特异304个。生长期特异SEs推定靶基因富集于干细胞增殖、角质形成细胞分化和细胞分裂等过程，以及PI3K-AKT、Notch和生长激素产生、分泌与作用通路；休止期特异SEs推定靶基因富集于细胞周期调控和负调控TGF-beta受体信号等过程，以及focal adhesion、ECM–receptor和Rap1通路。结论是SEs参与生长期与休止期阶段特异性基因表达调控。

3.4 转录组分析揭示毛囊周期中的基因表达动态：通过RNA-seq检测到24,406个mRNA和3,142个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），生长期相对休止期上调1,176个、下调1,966个。DEGs功能富集涉及皮肤屏障建立、细胞分化、上皮细胞分化、ECM组织、细胞黏附、负调控经典Wnt信号、正调控MAPK级联和毛囊形态发生；上调DEGs主要关联TGF-beta、cadherin、Hippo、MAPK和Wnt通路，下调DEGs富集于ECM–receptor、focal adhesion、calcium和FoxO通路。

3.5 CUT&Tag与RNA-seq整合分析揭示参与毛囊发育和周期的关键调控基因：按H3K27ac信号三分位分组后，RNA-seq表达在低、中、高信号组间差异显著（Kruskal–Wallis检验，H₍₂₎ = 1596，p < 0.001；ε² = 0.100），高信号基因总体表达更高；1,176个上调DEGs中722个、1,966个下调DEGs中1,573个关联至少一个H3K27ac峰。整合分析鉴定765个DEGs与差异H3K27ac相关基因重叠；上调DEGs在H3K27ac获得峰相关基因中显著富集（203 vs 111.26，1.82倍，OR = 2.22，p = 6.91 × 10^?19），下调DEGs在丢失峰相关基因中显著富集（562 vs 253.39，2.22倍，OR = 3.22，p = 9.41 × 10^?87）。表达增加且H3K27ac增强的基因包括DLX3、GRHL3、GRHL1、ZNF750、TCF7、CTNNBIP1、VANGL2、SMAD7和FGF5；表达降低且H3K27ac减少的基因包括WNT4、DKK1、DKK2、KITLG、FGF10、BMP6、PDGFRA、FST、TGFB3、TGFBR2、TGFBR3和SMAD3。结论是这些基因可能为天祝白牦牛毛囊发育和周期的候选调控因子。

讨论部分总结：研究人员指出H3K27ac富集与转录活性正相关，高H3K27ac信号组基因表达较高；14,496个差异峰表明毛囊周期伴随活跃染色质景观重塑，获得峰与丢失峰在远端基因间区和内含子的分布差异提示阶段相关远端调控参与；功能富集将生长期获得峰与Wnt、PI3K-AKT、MAPK、TGF-beta等毛囊激活和增殖网络联系，将休止期相对高富集峰与JAK–STAT、Hedgehog、ECM和黏附等静息与稳态网络联系；生长期和休止期特异SEs及LEF1、LHX2、FOXN1、GATA3等基序候选转录因子可能参与阶段特异转录程序；FGF5、PDGFRA等候选基因与毛囊周期调控相关。研究人员同时指出局限：样本未进行组织学分期验证，未区分初级和次级毛囊，bulk全层皮肤难以区分细胞组成变化与细胞内在调控。研究结论翻译：总之，对天祝白牦牛生长期和休止期皮肤组织H3K27ac的全基因组分析揭示了与毛囊周期相关的阶段特异性染色质景观；对差异富集H3K27ac区域相关基因及阶段特异性SEs的功能分析表明，这些调控元件参与毛囊发育和周期相关生物学过程；调控区分析进一步鉴定LEF1、LHX2、FOXN1和GATA3为与阶段特异性毛囊调控程序相关的候选转录调控因子。总之，这些发现为天祝白牦牛毛周期的表观遗传调控提供了见解，并为未来研究毛发生长和周期的分子机制奠定了基础。