CREB3L1相关基质表达在小鼠颧上颌缝机械重塑过程中的特征分析

《Biology》：CREB3L1-Associated Stromal Expression During Mechanical Remodeling of the Mouse Zygomaticomaxillary Suture

　　

摘要专业翻译 CREB3L1在机械性缝重塑过程中的表达尚未得到充分表征。研究人员检测了取自4周龄雄性C57BL/6J小鼠的牵张颧上颌缝（ZMS）组织及扩增的ZMS来源培养物中的转录本和染色情况。存档显微图像、四个单细胞文库、qPCR和micro-CT测量结果被分别评估。每个单细胞条件/时间点代表一个生物学样本。作者澄清后对61只动物的micro-CT数据进行了重新分析。精确检验分别对组织qPCR、培养皿qPCR和micro-CT采用独立的Holm校正。与假手术对照（SCs）相比，牵张成骨（DO）在第14天与更高的micro-CT骨体积相关（Holm校正后p = 0.0346），而区域骨矿物质密度在第3天和第28天时DO组较低（Holm校正后p分别为0.0227和0.0216）。每组4只动物时，组织Creb3l1和Spp1的平均估计值在第1天低于同日假手术参考值，在第3天高于参考值；11项组织qPCR比较均无显著性。两个静态培养皿和三个牵张腔室来自一次实验中一个合并的六只小鼠的制备物。牵张3天后，Creb3l1和Spp1的平均差异分别为?0.09和+0.11 log2单位；两者的校正后p值均为1.000。这些初步的结构和表达观察结果并未确立CREB3L1的激活或因果关系。小样本量、未重复的单细胞条件以及不完整的成像/批次元数据需要独立验证。

论文解读

一、研究背景与研究目的

颅颌面缝是连接相邻颅骨并容纳颅骨生长的纤维性界面，其中包含参与矿化和缝通畅性维持的干细胞群。机械加载可以改变这些细胞及其周围细胞外基质的行为，使缝成为研究物理需求与骨骼适应之间关系的理想模型。跨缝牵张成骨通过在缝上施加张力以促进颅颌面重塑。既往研究已表明Gli1阳性缝细胞参与扩张相关的骨重塑，并鉴定出Mkx作为牵张响应的调控因子。然而，基质相关转录如何伴随颧上颌缝的早期机械响应仍不明确。

CREB3L1（又称OASIS）是一种内质网膜相关转录因子，近期研究将其与成牙本质细胞谱系中的基质蛋白产生、分泌和牙本质沉积联系起来。单细胞分析提示CREB3L1调控子活性在成熟成骨细胞中最高。然而，mRNA和总CREB3L1免疫反应性无法揭示蛋白是否经历了蛋白水解加工和核转位。因此，在加载缝中建立其表达分布是测试这些机制的第一步。此外，加载缝中还含有可能修饰基质反应的免疫和血管细胞，中性粒细胞来源的制瘤素M已被涉及力诱导的颅颌面骨再生。本研究旨在描述机械牵张的小鼠ZMS组织和暴露于周期性牵张的扩增缝来源基质培养物中CREB3L1相关转录本和染色模式，为后续激活和功能研究确定焦点问题。

二、研究设计与主要发现概述

研究人员对假手术和机械牵张的ZMS组织及扩增的缝来源基质培养物进行了探索性研究。组织Spp1/Creb3l1 qPCR和单细胞谱涉及第1天和第3天；Sp7 qPCR涉及第7天；主要micro-CT和Masson比较涉及第14天。补充形态学跨越第1、3、7、14和28天。组织样本、测序文库和培养皿分别评估。日特异性组织和micro-CT组使用不同动物而非纵向测量。

重新分析存档的micro-CT测量数据包括61只动物，以双侧平均值为分析单位。第14天DO-SC平均骨体积差异为+0.353 mm3（精确p = 0.00433；Holm校正后p = 0.0346）。区域BMD平均差异在第3天为?64.681 mg HA/cm3，第28天为?67.739 mg HA/cm3（校正后p分别为0.0227和0.0216）。其余七项比较在校正后不显著。组织Spp1 log2相对表达中，牵张减假手术的平均差异在第1天为?1.42，第3天为+1.19，每组4只动物，两项比较均无统计学显著性（精确p = 0.200；Holm校正后p = 1.000）。

三、关键技术方法

本研究采用多种技术手段。动物实验使用4周龄雄性C57BL/6J小鼠，在戊巴比妥钠麻醉下将镍钛W形弹簧置于颞骨与鼻上颌区之间，从12 mm压缩至7 mm产生约30 g标称牵引力，假手术动物仅接受暴露和钻孔。组织学评估包括苏木精-伊红染色和Masson三色染色。单细胞分析使用SeekOne MM单细胞3′文库构建和NovaSeq 6000 PE150测序，共四个文库（SC1、DO1、SC3、DO3），每个条件/时间点一个生物学样本，通过Seurat 4.3.0整合和亚聚类分析成纤维样基质细胞，Monocle2构建DDRTree轨迹。micro-CT成像使用Quantum FX系统，90 kV、100 μA、10 μm体素分辨率，Mimics 20.0.0.691重建。培养实验将来自六只供体小鼠的ZMS组织合并建立单一细胞制备物，扩增至第3-7代，使用Cell Tank系统施加10%伸长率、1 Hz、每天6小时、持续3天的循环牵张。qPCR采用SYBR Green法，以Gapdh为内参，通过比较Cq法计算相对表达。免疫组织化学和免疫荧光使用抗CREB3L1/OASIS抗体。统计分析采用双侧精确Mann-Whitney检验，分别对组织qPCR（11项比较）、培养qPCR（2项比较）和micro-CT（10项比较）进行Holm校正。

四、研究结果

组织形态学和探索性Spp1测量。 第14天micro-CT重建记录了区域的位置和外观，Masson切片显示缝组织内的蓝色基质染色。重新分析显示第14天DO组骨体积显著高于SC组，第3天和第28天区域BMD显著低于SC组。组织Spp1表达在第1天和第3天均无显著差异，但方向性估计描述了可用动物的模式。

早期文库包含异质性基质表达谱。 整合的UMAP和组成图总结了四个文库中捕获的细胞。基质亚聚类解析出两种转录谱：簇0显示突出的Spp1、Bmp2、Runx2、Ibsp和Gpx3信号，而Cd36和Ptprb在簇1中更突出，分别命名为Spp1-Fib和Ptprb-Fib。基质细胞占据分支的Monocle2/DDRTree嵌入，提供后续基因叠加的通用转录坐标系统。

基质谱和组织中的CREB3L1表达。 六个转录本叠加将Sp7、Gata2、Creb3l1、Ets1、Runx2和Atf3映射到同一基质DDRTree投影上。Creb3l1和Sp7信号在右侧分支明显，而Gata2和Ets1信号在下左分支更明显。Creb3l1点图按日分开显示DO3中百分比表达标记最大。组织Creb3l1平均log2相对表达在DO1为?1.30 ± 0.64，DO3为1.85 ± 1.28，精确p值分别为0.057和0.114，Holm校正后为0.629和1.000。第7天Sp7值在SC7为0.00 ± 0.93，DO7为1.05 ± 1.62，无显著性。DAB棕色染色显示第1天和第3天假手术和牵张ZMS切片中可检测的CREB3L1免疫反应性，但未量化蛋白丰度或核激活。

扩增培养物显示基质标志物和诱导相关染色。 扩增培养物在成骨、成脂和成软骨诱导后分别显示茜素红S、油红O和阿利新蓝染色。流式细胞术门控内包含89.73% CD90阳性、92.46% CD44阳性和95.64% Sca-1阳性事件。CD29、CD31、CD34和CD117的分数分别为18.01%、0.04%、15.02%和1.04%。这些谱描述了混合扩增群体，未建立同质或谱系定义的干细胞身份。

三天培养牵张后的描述性转录测量。 接受阴性对照siRNA的培养物中，DO3的Creb3l1平均log2相对表达为?0.09 ± 0.37，Spp1为0.11 ± 0.45。两个静态培养皿和三个牵张腔室来自一个合并制备物。精确培养皿p值Creb3l1为0.800，Spp1为1.000；两个Holm校正后值均为1.000。未建立供体水平重复或等价检验。

扩展免疫分析描述周围转录环境。 中性粒细胞和单核细胞基因集显示包括炎症、迁移和信号相关类别。SPP1面板检查了DO3和SC3中的相对通路信息流和DO1和SC1中的全局相互作用计数网络。OSM相关转录本的细胞分布显示Osm信号在Ctse-Neu、Jun-Neu和遗留MPCs注释中明显，Lifr在成纤维样细胞中突出。组织Osm log2相对表达均值在DO1为1.85 ± 0.94，DO3为2.27 ± 0.64。所有六个相应的Holm校正后p值均为1.000。

五、讨论与结论

讨论部分指出，体内30 g弹簧力施加于复杂组织几何结构，而体外10%循环伸长是强加的腔室变形，无法转换为匹配剂量。全ZMS组织包含免疫、血管和基质成分并保留三维基质，而培养物通过外植体出生长和传代选择，第3-7代可能改变细胞状态或机械响应性。RhoA/ROCK-TAZ信号、PIEZO1机械敏感离子通道、PERK-TFEB通路等提供了力响应信号的可能切入点，但均未测试与CREB3L1的直接连接。CREB3L1丰度与活性需要区分，mRNA增加可能伴随前体积累而不增加活性核蛋白。基质产生可能反馈到物理刺激上，但方向无法从Col1a1丰度单独预测。在缝中，骨形成必须与未矿化界面共存，空间受限的响应尤为重要。免疫来源信号提供了加载影响基质细胞基质产生的额外途径。

研究结论为：该研究提供了牵张小鼠ZMS组织和扩增缝来源培养物中CREB3L1相关转录本和染色的初步描述。小规模组织比较无统计学显著性，培养观察未建立等价性或可重复的响应缺失。这些观察为缝定向颅颌面重塑的临床前研究提供指导，其中CREB3L1加工、基质功能和缝通畅性维持需要测试后才能建立治疗相关性。