链长优化型1,8-萘酰亚胺–布洛芬荧光探针用于HSA结合与细胞成像

《Sensors》：Chain-Length-Optimized 1,8-Naphthalimide–Ibuprofen Fluorescent Probe for HSA Binding and Cellular Imaging

　　

基于1,8-萘酰亚胺（NI）的荧光探针是用于生物系统中生物大分子传感与成像的具有吸引力的分子工具。本研究设计并合成了一组匹配的NI衍生物，其带有H、正己基或正辛基N-酰亚胺取代基以及末端丙烯酰胺或丙炔酰胺基团，以实证评价这些结构变量如何影响细胞活力和成像性能。在该化合物系列中，跨六种细胞系进行的MTT（四甲基偶氮唑盐）检测通常显示，含丙烯酰胺探针的细胞活力值高于其匹配的丙炔酰胺类似物，并且辛基取代的探针D3在基于MTT的细胞活力与细胞内荧光之间提供了有利平衡。探针D3发射绿色荧光，最大发射约550–560 nm，并与共聚焦细胞成像兼容。为将HSA结合能力引入优化的NI骨架，基于布洛芬对人血清白蛋白（HSA）Sudlow’s site II的已知结合偏好，制备了布洛芬功能化类似物探针D3–ibuprofen。HSA引起探针D3–ibuprofen吸收和荧光光谱的适度变化，而微尺度热泳（MST）证实了微摩尔级相互作用，表观K_d值为14.22 ± 4.43 μM。定量图像分析显示，经探针D3–ibuprofen/HSA处理的HeLa细胞中探针与4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的荧光强度比高于仅用探针处理的细胞，支持其用于HSA相关细胞成像的潜力。本工作为工程化用于蛋白质导向细胞成像的NI基荧光探针提供了一种链长导向策略。

研究背景与问题：1,8-萘酰亚胺（NI）衍生物具有较强光稳定性、化学稳健性、可调电荷转移性质和易结构修饰等优点，是荧光传感与生物成像的重要骨架。NI核心的N-酰亚胺氮可调节亲脂性和细胞通透性，芳环可引入识别或供电子基团以调节光学输出和靶标响应。然而，许多NI探针仍存在细胞摄取有限或浓度依赖性细胞毒性，限制其生物成像应用。疏水链工程可调节小分子探针与脂质膜的相互作用，烃链长度和不饱和度可影响脂质堆积、膜通透性和跨膜运输；因此，有必要在同一匹配系列中系统比较N-酰亚胺侧链与末端不饱和酰胺对荧光性能、细胞通透性和生物相容性的影响。人血清白蛋白（HSA，人血浆中最丰富的蛋白）在维持胶体渗透压及运输脂肪酸、药物、激素和内源性代谢物中发挥重要作用，其浓度、构象和配体结合能力改变与肝功能障碍、代谢紊乱、心血管疾病和炎症状态相关。荧光法较酶联免疫吸附测定（ELISA）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）操作更简便、成像兼容性更高并可行原位监测；配体导向可提高蛋白靶向识别并减少非特异性疏水或静电相互作用。布洛芬对HSA的Sudlow’s site II具有已知结合偏好，为该HSA响应型NI探针设计提供了依据。基于此，研究人员构建六种NI探针的匹配2 × 3分子系列，比较三种N-酰亚胺取代基（H、正己基、正辛基）与末端丙烯酰胺（D1–D3）或末端丙炔酰胺（E1–E3）的组合，评价其细胞行为和成像性能，筛选出D3后进一步制备布洛芬功能化类似物D3–ibuprofen，用于HSA相关细胞成像。

研究开展与结论意义：研究人员通过三步合成制备六种NI探针，并以核磁共振确认中间体和目标化合物结构；在细胞活力与细胞内荧光之间筛选出辛基取代且含末端丙烯酰胺的探针D3；随后将布洛芬偶联至共享的辛基取代胺中间体C3，得到D3–ibuprofen。研究结论表明，含丙烯酰胺的D系列探针通常较匹配的丙炔酰胺E系列具有更高的MTT细胞活力，D3在低细胞毒性和可检测细胞内荧光之间具有最有利组合；D3–ibuprofen与HSA存在微摩尔级相互作用，表观K_d为14.22 ± 4.43 μM，并且在HeLa细胞中D3–ibuprofen/HSA组的探针与DAPI荧光强度比高于探针单独组。该工作提出了链长优化与配体导向功能化相结合的策略，为蛋白质相关细胞成像用NI探针的工程化提供概念验证。

关键技术方法（不超过250字）：六种NI探针经三步合成，并以NMR确认结构；采用UV–Vis吸收与荧光光谱（含pH 4.5–8.0、λ_ex=440 nm及600 s连续激发光稳定性）评价光学性能；以MTT法在A2780、HeLa、PA-1、MCF-7、PC-12和293T细胞（获自ATCC或认证细胞库）中评估0–150 μM、24 h细胞活力；在MCF-7/HeLa及HeLa HSA组中进行共聚焦成像；以微尺度热泳（MST）测定HSA结合；以HPLC测纯度，并计算ALogP与极性表面积（PSA）。HSA购自Sigma-Aldrich。

研究结果：
探针设计与合成：通过三步反应构建NI荧光团，先以4-溴-1,8-萘二甲酸酐与相应胺反应构建酰亚胺核心，以系统调节N-酰亚胺取代基；再在溴化芳位引入乙二胺连接臂，提供供电子氨基取代基和末端反应性胺；最后以丙烯酰氯或丙炔酸酰胺化，分别得到含烯烃的丙烯酰胺衍生物D1–D3和含炔烃的丙炔酰胺类似物E1–E3。NMR确认所有中间体和目标化合物结构。该分子集用于比较N-酰亚胺侧链疏水贡献及烯烃/炔烃末端不饱和度的生物效应。
吸收、发射与pH响应：在既定水相条件下，六种探针均显示约435–440 nm的宽吸收带，故采用440 nm为后续荧光激发波长；在pH 4.5–8.0范围内，六种探针发射峰均约550–560 nm且最大发射位置无明显移动。D1和D2强度变化较小，D3随pH升高呈中度荧光强度下降；E1–E3的pH依赖强度变化更明显，尤其E3。结果表明发射波长在测试pH范围内稳定，但荧光强度尤其E系列并非完全pH独立，解释细胞环境荧光差异时需考虑pH依赖强度变化。
理化描述符与细胞活力：计算ALogP和PSA显示，N-酰亚胺烷基链延长使两类系列的预测亲脂性逐步升高：D1为1.458、D2为4.235、D3为5.147；E1为2.033、E2为4.810、E3为5.722；D1和E1的PSA为90.333 ?²，相应N-烷基化衍生物为80.875 ?²。MTT在A2780、HeLa、PA-1、MCF-7、PC-12和293T细胞中进行，探针浓度0–150 μM处理24 h；在该六探针系列中，含丙烯酰胺的D1–D3通常较匹配的E1–E3显示更高的细胞活力值。计算亲脂性与MTT细胞活力在本系列中并非简单单调关系；D3虽ALogP较高但仍保留较好细胞活力，而匹配的E3活力较低。上述比较描述理化与细胞活力谱，但不建立活力差异机制。
细胞成像与D3筛选：在MCF-7和HeLa细胞中以5 μM孵育4 h后进行共聚焦成像并定量探针与DAPI荧光强度比。E1在MCF-7中归一化荧光信号最强，E2在HeLa中最强，D3在两种细胞中呈中等但可 readily detectable 的信号。D系列主要定位于胞质区，与DAPI染色核重叠有限；部分E系列尤其HeLa中的E2和E3显示更强核相关荧光。D3的绿色发射可与蓝色DAPI核通道光谱分离，适用于标准共聚焦检测；但绿色荧光不具备红/近红外探针通常相关的低组织自发荧光、低光散射和更大成像深度，因此适用于本研究的培养细胞成像，可能限制深组织或体内成像。综合考虑成像性能与生物相容性，D3因在MTT细胞活力和细胞内荧光之间具有最有利总体平衡而被选为后续功能化骨架。
D3–ibuprofen的HSA结合与细胞成像：基于布洛芬对HSA Sudlow’s site II的已知偏好，制备D3–ibuprofen。HPLC在440 nm检测显示D3和D3–ibuprofen纯度分别为99.8%和99.2%。无HSA时，D3–ibuprofen吸收带约440 nm、发射峰约535 nm，Stokes位移约95 nm；加入HSA后440 nm附近吸光度适度增加，535 nm附近荧光强度轻微增强，两个光谱最大位置无明显移动，也无新吸收或发射带，Stokes位移基本不变。结果表明HSA结合主要引起适度强度调制，符合荧光团局部环境变化而非NI发色团电子结构显著改变；因未测定荧光量子产率和寿命，不能从现有数据赋予更详细激发态机制。MST确认D3–ibuprofen与HSA相互作用，表观K_d为14.22 ± 4.43 μM。HeLa细胞经D3–ibuprofen（5 μM）或D3–ibuprofen/HSA（5 μM/10 μM）37 °C孵育30 min后成像；对照HeLa绿色荧光可忽略，D3–ibuprofen处理显示清晰细胞荧光信号，定量图像分析显示D3–ibuprofen/HSA组探针与DAPI荧光强度比高于探针单独组。该分析支持观察到的细胞荧光差异，但不直接量化HSA浓度或内化探针量。
其他蛋白响应、光稳定性及边界：D3和D3–ibuprofen在牛血清白蛋白（BSA）、转铁蛋白（TRF）和IgG存在下仅显示小的荧光光谱变化；但有限荧光调制不能排除蛋白结合，这些测量也不能确立对HSA的优先结合，因此D3–ibuprofen对HSA相对于其他蛋白的选择性尚待建立。D3和D3–ibuprofen在440 nm连续激发、530 nm监测600 s内荧光强度仅小幅下降，表明测试激发条件下荧光衰减有限。D3–ibuprofen较D3的ALogP由5.147升至8.261，PSA保持80.875 ?²不变；ALogP和PSA为计算描述符，不直接证明水溶性、聚集行为或化学稳定性，故未仅据计算推断溶解性或稳定性改善。由于HSA仅引起适度溶液荧光变化且未建立浓度依赖分析校准曲线，不能确定可靠检测限；本研究证明D3–ibuprofen与HSA结合及其HSA相关细胞成像潜力，而非HSA定量测定。

讨论部分总结：讨论指出D3的绿色发射适用于培养细胞共聚焦成像，但不利于深组织或体内成像；小分子探针开发需整合光物理调控、分子识别和生物相容性，扭曲分子内电荷转移（TICT）调控是设计环境敏感荧光探针和成像剂的重要框架。HSA仅引起D3–ibuprofen适度强度调制，且未测量子产率和寿命，不能赋予详细激发态机制。ALogP和PSA为计算描述符，不能直接证明溶解性、聚集或稳定性。细胞荧光反映局部探针丰度和探针亮度，HSA结合可能影响探针递送、蓄积或滞留，细胞微环境也可能调节探针发射；现有数据不能区分这些过程的相对贡献，因此更强细胞荧光不能仅归因于溶液中适度荧光增强，HSA促进探针内化仍只是可能解释而非实验确立机制。其他蛋白仅引起小变化，但不能排除结合，也不能确立HSA选择性；本研究为概念验证性HSA相关传感，而非跨物种白蛋白选择性研究。
研究结论部分翻译：总之，通过系统调节N-酰亚胺烷基取代基和末端不饱和酰胺基团，开发了链长优化的NI荧光探针平台。在该六探针系列中，含丙烯酰胺的D探针通常较匹配的含丙炔酰胺E类似物表现出更高的基于MTT的细胞活力。带有辛基酰亚胺链的探针D3表现出低细胞毒性和可 readily detectable 的细胞内荧光的最有利组合。探针D3在绿色区域发射，最大发射约550–560 nm，支持其用于共聚焦细胞成像。与布洛芬缀合后，探针D3–ibuprofen保持相似的吸收和发射谱，显示HSA诱导的适度光谱变化，并以MST测定的表观K_d值14.22 ± 4.43 μM与HSA相互作用。定量图像分析显示，D3–ibuprofen/HSA组的归一化细胞荧光高于探针单独组。这些发现支持将链长优化和配体导向功能化整合用于蛋白质相关细胞成像。HSA相关成像结果仍为概念验证证据，未建立HSA定量检测或HSA促进的探针内化。在测试条件下，D3和D3–ibuprofen在600 s连续激发期间均显示有限荧光衰减。尚需进一步比较蛋白结合研究及在更接近生理相关的生物模型中的评价，以确立D3–ibuprofen的选择性和更广泛适用性。