对乙酰氨基酚（APAP）过量后肝祖细胞对肝细胞补充的贡献有限：基于谱系追踪小鼠模型的研究

《Biology》：Limited Contribution of Hepatic Progenitor Cells to Hepatocyte Replenishment After Acetaminophen Overdose

　　

肝再生是决定对乙酰氨基酚（acetaminophen, APAP）过量后存活的关键因素，主要由存活肝细胞的增殖驱动。肝祖细胞（hepatic progenitor cells, HPCs）是当肝细胞增殖受损时被激活的双能细胞。APAP过量后HPCs对肝再生的贡献尚不清楚。本研究采用谱系追踪小鼠模型，探讨在重度APAP过量后再生受损情况下HPCs对肝细胞再殖（repopulation）的贡献。研究人员将两月龄雄性C57BL/6J小鼠禁食过夜，然后给予600 mg/kg APAP过量（600APAP）。在谱系追踪实验中，研究人员向雄性ROSAmT-mG小鼠注射AAV8-TBG-Cre以标记肝细胞；AAV给药两周后，将小鼠禁食过夜，再给予600 mg/kg APAP过量，并在多个时间点收集肝脏和血液样本。接受重度APAP过量（600APAP）的C57BL/6J小鼠表现出明显肝损伤，血清ALT和肝坏死在72 h达到峰值，随后逐渐恢复。HPCs的激活表现为EpCAM、A6以及胆管细胞标志物CK19在恢复期表达增加。对ROSAmT-mG小鼠给予APAP所诱导的肝损伤及随后的再生和恢复与野生型小鼠相当。损伤后检测到HNF4α/tdTomato双阳性细胞（来源于非实质细胞的肝细胞），但仅占肝细胞总数的0.3%–0.6%。综上所述，该研究表明，尽管HPC/胆管细胞标志物增加，但在重度APAP诱导的肝损伤后再生受损期间，HPC/胆管细胞转分化对肝细胞补充的贡献极小。

肝脏具有强大的再生能力，在部分切除、化学损伤和饮食应激后，可通过存活肝细胞增殖和非实质细胞增殖恢复肝体积、结构与功能。肝祖细胞（hepatic progenitor cells, HPCs）是位于赫令管（canals of Hering）和门静脉周围的双能上皮细胞，在肝细胞增殖受抑时被激活，可分化为肝细胞和胆管细胞。对乙酰氨基酚（acetaminophen, APAP）过量是美国急性肝衰竭（acute liver failure, ALF）最主要的原因，其损伤程度呈剂量依赖性：中度过量时，死亡细胞主要由存活肝细胞增殖替代；而重度过量（如600 mg/kg）则导致肝再生受损、ALF和死亡。然而，HPCs在重度APAP过量后肝再生中的贡献尚未被详细评估。本研究利用谱系追踪小鼠模型，旨在明确再生受损条件下HPC/胆管细胞是否通过转分化直接补充肝细胞。研究人员建立600 mg/kg APAP（600APAP）严重肝损伤模型，并使用ROSAmT-mG谱系追踪系统特异标记成熟肝细胞，通过检测HNF4α/tdTomato双阳性细胞评估非实质细胞来源肝细胞的比例。结果发现，APAP过量后HPC/胆管细胞标志物表达增加，但HNF4α/tdTomato双阳性细胞仅占肝细胞总数的0.3%–0.6%。这提示肝细胞自我增殖仍是重度APAP损伤后修复的主要机制，HPCs的直接贡献有限，为未来针对肝细胞增殖而非祖细胞移植的治疗策略提供了实验依据。

研究人员使用8周龄雄性C57BL/6J小鼠和ROSAmT-mG小鼠（均购自美国Jackson Laboratory）。小鼠禁食过夜后腹腔注射600 mg/kg APAP。谱系追踪实验中，ROSAmT-mG小鼠先腹腔注射AAV8-TBG-Cre（2×10¹¹基因组拷贝/只）以在肝细胞中永久表达膜靶向GFP（mGFP），非实质细胞保持tdTomato红色荧光，2周后给予600APAP。分别于0、72、96、120 h收集肝脏和血清样本，每时间点4–5只存活小鼠。通过血清ALT活性测定和组织H&E染色评估损伤；免疫组化检测CK19；免疫荧光检测EpCAM、A6及HNF4α/tdTomato；使用QuPath软件定量，并用Mann-Whitney U检验进行统计分析。

**结果一：APAP过量诱导严重肝损伤。** 在C57BL/6J小鼠中，600APAP后120 h生存率为33%。血清ALT在72 h达到峰值，随后在96 h和120 h回落至接近基线。H&E染色显示72 h肝坏死面积为25.92%±7.9%，96 h降至9.8%±5.4%，120 h仅余2.79%±3.88%。说明600APAP可造成严重肝损伤并随后出现恢复。

**结果二：重度APAP过量后肝祖细胞标志物增加。** 免疫荧光检测显示，EpCAM阳性细胞在72 h增加至114.58±13.98个/视野，随后恢复至基线水平；A6阳性细胞从基线26.66±9.49增加至72 h的77.87±12.12个/视野，并持续至120 h。免疫组化显示，CK19阳性细胞从基线40.33±10.66增加至96 h的118.89±14.1个/视野并维持高水平。未发现CK19/HNF4α双阳性细胞，提示这些扩张的胆管/祖细胞未直接分化为肝细胞。

**结果三：肝祖细胞向肝细胞转分化极小。** 在ROSAmT-mG谱系追踪小鼠中，600APAP诱导的肝损伤与存活率（120 h为34%）和野生型小鼠相似。通过检测HNF4α/tdTomato双阳性细胞，发现其在72 h占HNF4α阳性肝细胞的0.48%，96 h为0.28%，120 h为0.43%，即每200倍视野仅约3–6个细胞。这表明即使肝细胞再生受损，HPC/胆管细胞转分化对肝细胞补充的贡献仍可忽略不计。

在讨论中，作者指出HPC/胆管细胞标志物增加可能反映HPC激活或胆管反应，而非转分化。已有的肝细胞克隆标记和单细胞测序研究均显示，APAP后肝修复主要依赖肝细胞自我增殖；HPC转分化受限可能与APAP损伤进程较快（小鼠约3–96 h）以及坏死主要位于中央静脉周围、而HPCs位于门静脉周围的空间分离有关。此外，HPC激活可能通过旁分泌信号调节炎症和肝细胞增殖，而非直接补充肝细胞。研究局限性包括HPC标志物特异性不足和存活偏倚。

研究结论可翻译为：本研究结果表明，严重对乙酰氨基酚过量在再生受损时诱导HPC激活和胆管上皮细胞扩张；但谱系追踪分析显示，HPC/胆管细胞来源的细胞占肝细胞总数不足1%，提示即使在严重损伤和肝细胞再生受损的情况下，HPC/胆管细胞对肝细胞补充的贡献也极小。