抑制天冬酰胺内切酶可延长衰老过程中的寿命并改善健康寿命

《iScience》：Inhibition of asparagine endopeptidase extends the lifespan and improves health span during aging

　　

## 摘要要点
- **#11a 可延长自然衰老野生型小鼠的寿命**
- **#11a 减轻衰弱并改善体能和认知功能**
- **#11a 减少 NAMPT 的裂解并改善 NAD?/SIRT1 相关指标**
- **#11a 减轻多个器官中与衰老和炎症相关的变化**

## 总结
天冬酰胺肽内切酶（AEP），又称豆素（legumain），是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，其活性随年龄增长而升高，并参与与年龄相关的组织功能障碍。我们检测了慢性抑制 AEP 是否能延缓自然衰老小鼠的衰老表型。本研究显示，慢性使用 AEP 抑制剂 #11a 可延长衰老 C57BL/6 小鼠的寿命并改善健康寿命，同时减少衰弱并改善体能和认知表现。#11a 治疗还减轻了多个器官中与衰老和炎症相关的多种指标。在机制层面，#11a 抑制了 AEP 依赖性烟酰胺磷核糖转移酶（NAMPT）的裂解，伴随 NAD?/NADH 比值升高和 SIRT1 水平增加。这些发现支持对药理学 AEP 抑制作为促进健康衰老策略的进一步研究。

## 引言
天冬酰胺肽内切酶（AEP），又称豆素（LGMN），是一种在酸性条件下激活的半胱氨酸蛋白酶，属于 C13 肽酶家族。AEP 广泛分布，主要在肾脏和睾丸中表达。作为一种酶，AEP 特异性地在天冬酰胺残基后切割其底物，主要定位于内质-溶酶体系统；然而，在病理生理条件下，AEP 也定位于细胞质或细胞核中。越来越多的证据将异常 AEP 激活与多种与年龄相关的病理过程联系起来，特别是在暴露于溶酶体应激和慢性炎症的组织中。在此状态下，AEP 切割多种靶蛋白，产生碎片化的、通常为致病性的版本，从而导致细胞功能障碍。例如，我们曾报道 AEP 切割 Tau N368，产生神经毒性片段并聚集，导致神经原纤维缠结（NFT）形成，这是阿尔茨海默病（AD）和大脑衰老的标志。此外，AEP 还将 α-突触核蛋白（α-Syn）加工为截短形式，更易聚集，促进帕金森病（PD）的发病。此外，AEP 介导的 SET（蛋白磷酸酶 2A [PP2A] 抑制剂，又称 I2PP2A）在神经元中的裂解损害碱基切除修复途径，促进 DNA 损伤积累。

细胞衰老的特征是衰老相关分泌表型（SASP），这是一种强效的促炎分泌组，可破坏组织功能并促进慢性炎症（"炎性老化"）。多项研究将 AEP 活性与神经炎症信号传导及相关组织损伤联系起来。衰老还与自噬——细胞回收过程——的下降有关。失调的 AEP 活性可能通过干扰溶酶体功能和蛋白水解稳态加剧这一下降，导致受损蛋白质和细胞器的积累。因此，AEP 的有害作用为基本衰老过程与主要年龄相关疾病（包括神经退行性疾病、癌症和心血管疾病）之间的机制联系提供了合理的解释。例如，AEP 通过切割 Tau 和 α-Syn 与 AD 和 PD 相关。AEP 在肿瘤中常过表达，并参与加工与肿瘤侵袭、转移和血管生成相关的蛋白质。此外，AEP 已成为与动脉粥样硬化发展和血管炎症相关的新型生物标志物。最近我们证明，AEP 在患者动脉粥样硬化斑块中增强，并蛋白水解切割载脂蛋白 A1（APOA1），损害胆固醇外排和高密度脂蛋白（HDL）形成，从而促进动脉粥样硬化病理。AEP 表达还在全脑照射野生型小鼠的皮层和海马中显著上调，AEP 基因缺失减轻了照射诱导的神经功能缺陷，同时与神经元衰老减少相关。综合这些观察结果，支持检测药理学 AEP 抑制是否能改善与衰老相关的表型。在本研究中，我们使用特异性抑制剂 #11a 在自然衰老小鼠中检验了这一可能性。

## 结果

### AEP 抑制剂 #11a 延长寿命并改善健康寿命

与年龄相关的 AEP 过度激活与多种与衰老相关的病理过程有关。因此我们评估了优化后的 AEP 抑制剂 #11a——该抑制剂具有良好口服生物利用度和有利的体内药代动力学（PK）特征——是否能对自然衰老的 C57BL/6 野生型小鼠产生延寿效果。小鼠被饲喂标准饲料或补充 #11a 的饲料（0.056 g/kg 饲料，相当于约 7.5 mg/kg/天），从约 18 月龄开始给药，同时进行寿命和健康寿命分析。#11a 介导的 AEP 抑制与更长的存活相关，对照组平均存活年龄为 24 个月，#11a 治疗组为 28 个月。对照组死亡风险显著高于 #11a 组（Mantel-Haenszel 风险比 [对照/#11a] = 2.08，95% CI 1.02–4.27，p = 0.0454）（图 1A）。虽然 #11a 不影响体重，但摄食量在笼水平进行评估（图 S1A 和 S1B）。在治疗后 1–5 个月的平衡期（每组六个笼在每个时间点提供数据），双因素重复测量 ANOVA 显示处理无显著主效应（F (1,10) = 2.91，p = 0.119）或处理×时间交互作用（p = 0.430）。尽管如此，#11a 治疗笼的摄食量在多个时间点数值上较低。因此，摄食量改变仍可能是观察到的长寿和代谢表型的潜在贡献因素。我们随后使用 29 项表型的衰弱指数（FI）测量健康寿命，对严重程度进行盲评评分（0、0.5 或 1），作为两性中与年龄相关的衰退指标。从 18 月龄开始，每 4 周进行一次重复评估，每组生成 14–15 个数据集。总体 FI（定义为所有表型的平均值）作为发病率风险指标（图 1B）。由于我们对相同的小鼠进行纵向测量，我们使用了混合模型，将每只小鼠作为随机效应，处理/时间作为固定效应。该模型在统计上比标准 ANOVA 更为高效（χ2，p < 0.0001）。分析显示，使用 #11a 阻断 AEP 减轻了衰老表型并延缓了雌雄两性的发病（图 1B–1D）。此后，我们利用混合模型测试了 #11a 处理对年龄依赖性表型的影响（图 1E 和 1F）。#11a 显著降低了雌性多种年龄依赖性表型的严重程度，包括小鼠 grimace、体型状况、前肢握力和听力丧失。值得注意的是，#11a 显著降低了雌性小鼠中与运动相关的病症严重程度，包括步态异常和前庭功能紊乱（图 1E）。在雄性中，小鼠 grimace、白内障、毛色丧失、尾部僵硬、威吓反射、直肠脱垂和腹泻的严重程度均有所降低（图 1F）。

### 图 1：#11a 延长寿命并改善健康寿命

- **(A)** 对照组（n = 26）和 #11a 饲料组小鼠（n = 26）的 Kaplan-Meier 生存曲线。采用 log-rank 检验进行统计学比较。阴影区域表示拟合曲线的 95% 置信区间。
- **(B)** 生命周期内总衰弱指数（FI）评分，比较对照组小鼠（紫色）与从 18 月龄开始饲喂 #11a 饲料的小鼠（绿色）。每个点代表一只动物；n 代表每个测量时间点存活的动物总数。采用混合模型对数据进行纵向分析。应用线性混合效应模型，以小鼠 ID 作为随机效应，处理和时间作为固定效应。混合模型拟合与简单 ANOVA 模型使用卡方检验进行比较。
- **(C 和 D)** 随年龄显著增加的衰弱表型单独绘图，比较对照组与 #11a 饲料组的 (C) 雌性 和 (D) 雄性队列。每个时间点评估的动物数量显示在每个图表下方的行中。
- **(E 和 F)** 研究中 (E) 雌性和 (F) 雄性小鼠年龄依赖性衰弱表型的轨迹。采用混合模型评估 #11a 对各表型的影响。

数据以均值 ± SEM 表示（除另有说明外）。显著性水平标注如下：*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；****p < 0.0001。

在受 #11a 影响的衰弱指标中，与年龄相关的视力丧失和毛发状况改善最为显著。使用苏木精-伊红（H&E）染色进行组织学分析显示，#11a 处理与衰老小鼠晶状体结构改善和白内障发生率降低相关。这伴随视网膜内核层（INL）和外界层（ONL）细胞密度增加（图 S1C）。

通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测量血浆 #11a 浓度（图 S2A）。经 5 个月治疗后，对心、肝、脾、肺和肾等主要器官进行组织病理学评估，在该中间时间点的受检组织中未发现明显异常（图 S2B）。与此一致，全血细胞计数（CBC）和血清生化分析未在评估参数中发现主要异常（表 S1）。

### 抑制 AEP 减轻衰老过程中的体能和认知衰退

为检测 #11a 对与年龄相关的体能和认知衰退的影响，在 23 月龄的 C57BL/6 小鼠中进行行为学评估。我们发现，5 个月 AEP 抑制显著提高了坠落时间和坠落速度，同时与载体对照相比在跑台上停留时间有延长趋势（图 2A）。钢丝悬挂试验显示，#11a 显著增加了相对于对照组的悬挂时间（图 2B）。在旷场试验中，#11a 处理小鼠表现出改变的探索行为，包括总移动距离增加、中心区域探索增加和静止时间减少，尽管由于当前数据集未完全区分焦虑相关行为与一般运动能力变化，这些结果应谨慎解读（图 2C 和 2E）。23 月龄时的行为测试也支持 #11a 处理小鼠在新物体识别（NOR）测试（辨别指数：32% ± 15.69% vs 48% ± 11.03%；p = 0.0071，n = 12）和 Y 迷宫测试（探索时间：68 s ± 20.85 vs 102 s ± 20.35；p = 0.0005，n = 12）中的表现改善（图 2C–2H）。

### 图 2：#11a 改善与年龄相关的体能和认知功能衰退

- **(A)** 对照组和 #11a 处理小鼠的跑台表现。从力竭试验中获取平均坠落时间（左）和最大坠落速度的平均值（中），从耐力试验中获取停留时间（右）（n = 12）。
- **(B)** 钢丝悬挂测试表现（n = 12）。
- **(C)** 旷场试验的代表性轨迹。
- **(D)** 新物体识别测试的代表性轨迹。
- **(E)** 旷场试验的行为参数：移动距离、进入中心区域总次数、在中心区域停留总时间和静止时间（n = 12）。
- **(F)** 新物体识别测试用于评估识别记忆（n = 12）。
- **(G)** Y 迷宫测试的代表性轨迹。
- **(H)** Y 迷宫测试用于评估空间工作记忆（n = 12）。
- **(I)** 23 月龄采集的股骨结构 micro-CT 代表性图像，包括骨小梁和皮质骨。比例尺：1.0 mm。
- **(J)** 连通密度（Conn.D）的 micro-CT 测量。
- **(K)** 股骨的代表性 H&E 染色图像（上）及框选区域的高倍镜视图（下）。比例尺：200 μm。
- **(L 和 M)** 海马中 APP、APP N585、Tau 5 和 Tau N368 蛋白水平的 Western blot 分析（L）及定量（M）（n = 6）。

数据以均值 ± SD 表示。对于行为学测试，每组 n = 12；对于 micro-CT、组织学和免疫印迹分析，每组 n = 6，除另有说明外。通过非配对双尾 Student's t 检验确定统计显著性。显著性水平标注为 *p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

在处死后收获股骨进行 micro-CT 分析显示，#11a 处理小鼠的连通密度（Conn.D）显著增加（图 2J），而大多数其他骨小梁和皮质骨参数无显著改变（图 S3）。然而，#11a 未显著改变其他骨小梁骨微结构参数，包括骨表面积（BS）、骨体积分数（BV/TV）、总体积（TV）、骨表面积/骨体积比（BS/BV）、骨表面积/总体积比（BS/TV）、结构模型指数（SMI）、骨小梁间距（Tb.Sp）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）（图 S3A）。此外，皮质骨形态学参数，包括皮质骨厚度（Ct.Th）、皮质骨面积（Ct.Ar）和皮质骨面积/组织总面积比（Ct.Ar/Tt.Ar），经 #11a 慢性处理后也无显著变化（图 S3B）。

为进一步探究与#11a相关的衰老骨骼表型，我们进行了H&E染色并分析了骨形态和白色脂肪细胞。我们观察到，与溶剂对照组相比，#11a处理小鼠的骨骼中白色脂肪细胞减少，骨小梁增加（图2K）。我们此前的研究表明，AEP在N585位点切割淀粉样前体蛋白（APP）并刺激Aβ的产生，同时在N368位点切割Tau蛋白，触发其过度磷酸化和聚集。因此，我们进行了免疫印迹分析，发现#11a阻断了AEP对APP N585和Tau N368的切割降解（图2L和2M）。这些发现与#11a抑制AEP后在新奇探索（NOR）和Y迷宫测试中观察到的认知功能改善结果一致。综上，这些数据支持#11a治疗与减缓衰老相关的身体和认知功能衰退之间的关联。

阻断AEP减少NAMPT的降解并提高SIRT1水平

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是众多关键生物通路中必不可少的酶辅因子和共底物。烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）是从烟酰胺催化NAD+生物合成的限速酶。最近，我们报道了AEP在N136位点切割NAMPT并消耗NAD+，触发神经元衰老和认知缺陷。敲除AEP或阻断AEP对NAMPT的切割可减轻神经元Thy 1-C/EBPβ转基因（Tg）小鼠中的这些缺陷。为检验AEP抑制剂#11a是否通过干扰AEP对NAMPT的切割降解并延缓脑衰老来改善认知功能，我们对海马组织进行了免疫印迹分析，发现#11a显著降低了活性AEP水平。因此，活性AEP对NAMPT N136的切割降解减少，这通过识别截短型但不识别全长NAMPT的C137特异性抗体得到了验证。Sirtuins（SIRTs）是一个进化上保守的NAD+依赖性去乙酰化酶家族，在多种模式生物的衰老和寿命调控中发挥关键作用。普遍表达的转录共激活因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）作为线粒体功能的主调控因子，在脑中高度表达，介导脑衰老。PGC-1α是SIRT1的下游靶点。随后，#11a使SIRT1和PGC-1α水平升高（图3A）。为评估SIRT1以外的主要NAD+消耗通路是否促成了这些观察结果，我们检测了CD38蛋白丰度、CD38 NAD酶活性以及作为PARP通路读出指标的全局聚腺苷二磷酸核糖（PAR）水平。海马或股四头肌组织中，#11a治疗未显著改变CD38蛋白水平（图S5A和S5B）。重组人CD38表现出强烈的ε-NAD水解活性，该活性被CD38抑制剂78c抑制，证实了检测系统的响应性。在海马和股四头肌组织裂解液中，加入78c降低了NAD酶信号，表明所测ε-NAD水解中相当一部分依赖于CD38。在这些检测条件下，#11a治疗未显著改变CD38 NAD酶活性（图S5C和S5D）。同时，作为技术阳性对照，H2O2增加了HT22细胞的PAR化水平，而olaparib减少了这种诱导，验证了PAR检测（图S5E和S5F）。在脑和股四头肌组织中，#11a在检测条件下未显著改变PARP1蛋白丰度或全局PAR水平（图S5G和S5H）。这些发现并未确立#11a对CD38或PARP的直接靶标结合。使用针对总AEP和活性AEP抗体的免疫荧光（IF）共染色显示，CA1和CA3区域的脑海马神经元中活性AEP荧光强度相对于总AEP显著降低（图3B）。免疫印迹分析和IF图像定量均证实了这些观察结果（图3C和3D）。此外，AEP酶活测定进一步证实#11a强力抑制了脑中的AEP活性（图3E）。我们还在股四头肌组织中也进行了类似的生化检测，发现#11a同样抑制了肌肉中活性AEP和NAMPT C137的切割，并伴有SIRT1和PGC-1α水平升高（图3F和3G），以及纤维化进展标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的减少（图3H）。此外，#11a显著提高了脑、肌肉、肝脏和肾脏组织中的NAD+/NADH比值，这与抑制AEP介导的NAMPT切割有助于维持NAD稳态的观点一致（图3I，另见图S4中的NAD+和NADH水平）。综上，这些结果表明#11a抑制AEP活性，减少NAMPT的降解，并与脑和肌肉中SIRT1及PGC-1α水平的升高相关。

图3 #11a调节老龄小鼠组织中的衰老相关通路

(A和C) 23月龄小鼠海马中AEP、C/EBPβ LAP、NAMPT、NAMPT C137、SIRT1和PGC-1α蛋白水平的Western blot分析（A）及定量（C）（n = 6）。

(B和D) 海马中总AEP、活性AEP和NeuN的免疫荧光染色（B）及定量（D）（n = 6）。比例尺：50 μm。

(E) 海马组织裂解液中的AEP酶活性测定（n = 6）。

(F和G) 股四头肌中AEP、C/EBPβ LAP、NAMPT、NAMPT C137、SIRT1和PGC-1α蛋白表达的Western blot（F）及定量（G）（n = 6）。

(H) 股四头肌切片中AEP和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的免疫荧光染色及定量（n = 6）。比例尺：50 μm。

(I) 脑、股四头肌、肝脏和肾脏组织中的NAD+/NADH比值测定（n = 6）。

数据以均值±标准差表示。统计显著性通过非配对双尾Student's t检验确定。显著性水平表示为?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001。

AEP的抑制与衰老期间代谢及脂肪相关指标改善相关

胰岛素敏感性下降（胰岛素抵抗）和脂肪组织重塑改变是衰老的标志性代谢特征。这些过程密切相关，形成恶性循环，推动衰老相关的代谢功能障碍并增加2型糖尿病、心血管疾病和衰弱症的风险。值得注意的是，葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）均显示，与溶剂对照组相比，#11a治疗显著提高了胰岛素敏感性并降低了血糖浓度（图4A和4B）。此外，血浆中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和乳酸脱氢酶（LDH）浓度显著降低（图4C）。组织学分析显示，#11a显著减少了棕色脂肪组织（BAT）和腹股沟白色脂肪组织（iWAT）中脂肪细胞的堆积，油红O染色进一步验证了这一点。随着脂肪细胞的减少，胫前肌（TA）纤维直径显著增大（图4D和4E）。BAT和iWAT还产生脂肪因子并参与衰老相关的炎症重塑。定量逆转录PCR（RT-qPCR）分析显示，在慢性#11a治疗后，BAT中涉及葡萄糖或脂肪酸代谢的若干关键基因，包括Adipoq（脂联素）、Glut4和Pparg，以及iWAT中的Pgc1a、Ucp1和Dio2，均显著升高（图4F和4G）。

图4 #11a与部分代谢及脂肪相关指标的改善相关

(A) 左：腹腔注射葡萄糖（2 g/kg体重）后GTT期间的血糖水平（mM）。阴影区域表示拟合曲线的95%置信带。右：GTT的曲线下面积（AUC）（n = 12）。

(B) 左：腹腔注射胰岛素（0.5 U/kg体重）后ITT期间的血糖水平（mM）。阴影区域表示拟合曲线的95%置信带。右：ITT的AUC值（n = 12）。

(C) 使用标准自动化生化检测测定的血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和乳酸脱氢酶（LDH）浓度（n = 6）。

(D) 代表组织学图像，显示腹股沟白色脂肪组织（iWAT）、棕色脂肪组织（BAT）、胫前肌（TA）的H&E染色及iWAT的油红O染色。比例尺：50 μm。

(E) 基于(D)的iWAT和BAT中脂肪细胞面积及TA纤维横截面积的定量（n = 6）。

(F和G) (F) BAT和(G) iWAT中关键代谢基因的定量实时PCR（实时qPCR）分析（n = 6）。基因表达以Gapdh为内参归一化，并以相对于对照组的倍数变化表示。

数据以均值±标准差表示。AUC和其他终点比较使用非配对双尾Student's t检验。显著性水平表示为?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001。

由于内分泌状态可能影响衰老相关的代谢重塑，我们进行了一系列检测以评估血清生化指标和生殖激素谱。具体而言，我们定量了血清肌酸激酶及其MB同工酶，并进行了肝功能检测（白蛋白、总胆汁酸和γ-谷氨酰转移酶）和肾功能检测（尿素、尿酸和肌酐）。我们发现#11a未显著改变这些指标（图S6A–S6C）。此外，#11a处理的老龄小鼠与对照组之间的血浆进食状态胰岛素、葡萄糖和糖化血清蛋白（GSP）水平保持不变（图S6D）。此外，血浆血脂谱，包括甘油三酯（TG）、胆固醇（CHO）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），在溶剂对照组和#11a处理小鼠之间保持可比（图S6E）。循环生殖激素，包括雌二醇、睾酮、促卵泡激素（FSH）和促黄体生成素（LH），在组间也无统计学显著差异，尽管雌二醇和睾酮在#11a处理小鼠中均呈现升高的趋势（图S6F和S6G）。因此，这些激素发现应被解释为探索性的，而非确证激素介导机制的证据。

AEP抑制减少多个器官中的衰老和炎症相关指标

衰老细胞高表达一种特异性溶酶体β-半乳糖苷酶。衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）是识别衰老组织和培养中衰老细胞的广泛使用且经典的生物标志物。因此，我们在肝脏、肺和iWAT中进行了SA-β-Gal染色，代表性图像显示#11a处理组织中的衰老相关染色减少（图5A）。马松三色染色是一种主要用于区分胶原与其他组织（特别是肌肉和上皮细胞）的组织学染色。其主要目的是可视化和评估组织中的纤维化。马松染色提示肝脏和肾脏中纤维化相关改变减少，这由以下定量分子读出进一步评估（图5B）。细胞衰老与细胞周期阻滞相关。肿瘤抑制因子p53和p16是关键衰老效应分子；p53主要通过p21发挥作用，而p16直接抑制CDK4/6。免疫印迹分析显示，#11a治疗后肝脏和肾脏中这些衰老生物标志物呈下降趋势，而在肺中则呈现变异（图5C–5E）。RT-qPCR分析进一步证实，肾脏中p21WAF1和p16Ink4a的mRNA表达水平均显著降低（图5F和5G）。IF染色进一步证实，#11a显著抑制了肾脏和肝脏中p21、p16和活性AEP的水平，而Lamin B1则升高（图5H–5K）。AEP活性被炎症细胞因子上调，并参与炎症通路组分的加工，形成衰老相关炎症促进AEP活性、进而加剧炎症损伤的恶性循环。因此，在老龄小鼠中使用#11a阻断AEP后，与对照小鼠相比，老龄小鼠的脑、肌肉、肝脏、肺和肾脏组织中IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著降低（图5L–5P）。

图5 AEP抑制减少多个器官中的衰老和炎症相关指标

(A) 23月龄对照组和#11a处理小鼠的肝脏、肺和iWAT的代表性SA-β-Gal染色图像。

(B) 肝脏和肾脏组织的代表性马松三色染色，其中带标记处进行了定量（n = 6）。比例尺：50 μm。

(C–E) 肝脏（D）和肾脏（E）中p53、p21和p16蛋白水平的Western blot分析（C）及定量（D和E）（n = 6）。

(F和G) 肝脏、肺、肾脏、BAT和iWAT中p21（F）和p16（G）mRNA表达的qPCR分析（n = 6）。

(H–K) 肝脏和肾脏切片中AEP、Lamin B1、p21和p16的IF染色（H和I）及定量（J和K）（n = 6）。比例尺：50 μm。

(L–P) 脑（L）、肌肉（M）、肝脏（N）、肺（O）和肾脏（P）中TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度。

数据以均值±标准差表示。统计显著性通过非配对双尾Student's t检验确定。

显著性水平表示为 ?p < 0.05, ??p < 0.01, ???p < 0.001, ????p < 0.0001。

#11a 减轻细胞衰老并通过抑制AEP减少NAMPT裂解

为进一步评估#11a在应激相关细胞模型中的作用，我们在有或无#11a存在的情况下用H2O2处理HT22细胞，发现#11a强有力地抑制了H2O2诱导的SA-β-Gal染色增加（图6A）。免疫印迹分析显示，H2O2强烈诱导AEP激活并增加NAMPT C137片段化，而这两者均被#11a减弱，同时伴随SIRT1升高（图6B和6C）。炎症细胞因子包括Il1b、Il6和Tnfa也被H2O2大幅升高，并被#11a降低（图6D）。综上，这些数据表明#11a减轻了该模型中多种应激和衰老相关的生物标志物，并减少了NAMPT裂解。由于细胞在H2O2暴露后24小时被收集，这些数据应被解读为反映早期应激和衰老相关反应，而非完全建立的衰老程序。在此急性条件下，NAD+/NADH比率基本未改变，但#11a仍能限制NAMPT裂解并抑制早期衰老样变化（图6E）。

图6 #11a在体外减轻衰老相关和应激相关表型并减少NAMPT裂解

(A) HT22细胞各组SA-β-Gal染色的代表性图像和定量。DMSO作为载体对照（n = 3）。比例尺：100 μm。

(B和C) AEP、C/EBPβ、NAMPT C137、SIRT1和PGC-1α蛋白表达的Western blot（B）和定量（C），在H2O2诱导的HT22细胞应激相关模型中（n = 3）。

(D) HT22细胞中Tnfa、Il1b和Il6 mRNA水平的qPCR分析（n = 3）。

(E) 测量了在有无#11a条件下暴露于H2O2的HT22细胞中NAD+/NADH比率（n = 3）。

(F) C2C12细胞各组SA-β-Gal染色的代表性图像和定量。DMSO作为载体对照（n = 3）。比例尺：100 μm。

(G和H) AEP、C/EBPβ、p53、p21和p16蛋白水平的Western blot（G）和定量（H），在D-半乳糖（20 mg/mL）诱导的C2C12细胞衰老模型中（n = 3）。

(I和J) C2C12细胞中AEP（I）和p21（J）的免疫荧光染色（n = 3）。比例尺：100 μm。

(K) 测量了在有无#11a条件下暴露于D-半乳糖的C2C12细胞中NAD+/NADH比率（n = 3）。

数据以均值±标准差表示。统计学显著性通过普通单因素方差分析和Bonferroni多重比较检验确定。显著性水平表示为 ?p < 0.05, ??p < 0.01, ???p < 0.001, ????p < 0.0001。

D-半乳糖（D-gal）通常用于实验诱导加速衰老样和衰老样表型，其机制通过氧化应激实现。我们接下来评估了#11a在暴露于D-gal的C2C12细胞（一种永生化小鼠成肌细胞系）中的作用。同样，#11a显著抑制了D-gal诱导的SA-β-Gal染色增加（图6F）。免疫印迹显示D-gal显著提高了C2C12细胞中AEP的激活水平。此外，p53、p21和p16均相应升高，而这些效应被#11a大大减弱（图6G和6H）。D-gal处理后AEP激活和p21升高的生化事件通过免疫荧光染色进一步证实，活性AEP和p21的荧光强度被#11a大幅减弱（图6I和6J）。此外，D-半乳糖降低了C2C12细胞中的NAD+/NADH比率，而#11a恢复了该比率，支持其对细胞NAD+氧化还原平衡的语境依赖性效应（图6K）。因此，#11a在该细胞模型中减轻了多种衰老相关特征，并减少了活性AEP相关的NAMPT裂解。

讨论

我们的发现支持AEP参与多种与衰老相关的病理过程这一观点，并且AEP的药理学抑制可能改善几种与年龄相关的表型。在本研究中，#11a减轻了雄性和雌性小鼠的多重衰弱指数，并与年龄相关的身体和认知功能下降减轻相关联。同时，#11a减少了NAMPT裂解，并与更高的NAD相关指标以及SIRT1和PGC-1α水平升高相关联。#11a处理还与胰岛素敏感性改善以及BAT和iWAT中与脂肪相关变化减少相关联。此外，#11a减少了SA-β-Gal染色并降低了多个器官中多种衰老和炎症相关标志物。综上，这些观察结果与我们最近的报告一致，即给予烟酰胺单核苷酸（NMN）或#11a可改善Thy1-C/EBPβ转基因小鼠和线虫中的年龄相关疾病并延长寿命，进一步支持AEP作为治疗相关靶点。

NAD+是一种关键的酶辅因子，参与众多生物学通路。NAMPT作为从烟酰胺生物合成NAD+的限速酶发挥作用。在前脑兴奋性神经元中，细胞内NAMPT介导的生物合成是维持NAD+水平的主要机制，这对神经元存活和功能至关重要。前脑兴奋性神经元中NAMPT条件性敲除小鼠（CaMKIIα-NAMPT?/?）出现海马和皮层萎缩、星形胶质细胞增生、小胶质细胞增生和异常的CA1树突形态，同时伴有显著的运动和认知缺陷。NAMPT的关键作用进一步体现在其CA1区域敲低可复制年龄相关的认知表型，而随后通过NMN给药可加以改善。利用烟酰胺核糖（NR）和NMN等前体进行NAD+治疗性增强可减轻各种AD动物模型和AD诱导的多能干细胞（iPSC）来源神经元中的认知缺陷、Aβ病理和Tau病理。此外，NAD+增强恢复线粒体功能并改善年龄相关下降。NAD+的功能意义主要通过sirtuins介导，sirtuins是一个进化上保守的NAD+依赖性去乙酰化酶家族，在衰老和长寿的调控中不可或缺。因此，我们的数据支持这样一个模型：#11a通过抑制AEP来抑制NAMPT裂解，并与改善的NAD相关指标相关联，从而可能有助于减少衰老相关变化（图3、6和S4）。尽管这些发现与#11a调节AEP-NAMPT-NAD+/SIRT1/PGC-1α通路的模型一致，但在自然衰老小鼠中目前的证据仍主要属于相关性证据。需要额外的因果研究来确定该通路在多大程度上是这里观察到的生存和健康寿命表型所必需的。为进一步检查#11a的NAD相关效应是否可能由其他主要NAD消耗通路的活动改变所解释，我们评估了CD38 NAD酶活性和全局PAR水平作为功能通路指标。在测试条件下，#11a未显著改变脑组织和股四头肌中的CD38 NAD酶活性或全局PAR修饰（图S5）。这些观察结果并未确立#11a对CD38或PARP的直接靶点结合。

CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPs）属于碱性亮氨酸拉链DNA结合蛋白家族，与中枢神经系统（CNS）炎症有关。越来越多的证据将C/EBPβ定位为衰老过程的主要调节因子。它在介导癌基因诱导的衰老和SASP（特别是促炎细胞因子和趋化因子的表达）中发挥关键作用。C/EBPβ还与NF-κB协同激活衰老细胞中与SASP相关的基因。跨人类组织分析衰老相关基因一致鉴定出细胞周期调节因子CDKN1A（p21）以及SASP调节因子如CEBPB和MAP2K3。生物信息学研究进一步将p53、BDNF、CDKN1a和C/EBPβ与衰老加速小鼠P8（SAMP8）模型中的大脑衰老相关联，而统计证据证实了cebpb对小鼠衰老的影响。其他发现将C/EBPβ与健康和寿命决定联系起来。例如，与年龄相关的DNA甲基化变化与衰老有关，而C/EBPβ结合位点的去甲基化受损可诱导早衰表型。值得注意的是，Cebpb是筛选衰老相关基因转录调节因子中的顶级候选基因。C/EBPβ在AD大脑中上调。我们已证明其在时间上调节AEP表达，AEP裂解APP N585和Tau N368，触发AD发病机制。

最近，我们的工作证明了C/EBPβ在Thy1-C/EBPβ转基因小鼠中的神经元特异性过表达可复制年龄相关表型并缩短寿命。最新研究表明，年龄相关的神经元C/EBPβ上调是衰弱和寿命的决定因素，其作用通过AEP在N136处蛋白水解裂解使NAMPT失活来实现。C/EBPβ表达升高促进神经元衰老和丧失，这一过程在机制上与活性AEP蛋白水解裂解NAMPT相关联，最终导致NAD+耗竭。AEP基因消融或AEP抗性NAMPT N136A突变体的表达显著延长神经元特异性Thy1-C/EBPβ转基因小鼠的寿命。同样，线虫C/EBPβ同源物cebp-2的神经元过表达缩短寿命并降低NAD+水平，而给予NMN或AEP抑制剂#11a可挽救这些效应。给予NMN或#11a均能大幅改善Thy1-C/EBPβ小鼠的认知和运动缺陷并提高其预期寿命。值得注意的是，抑制剂#11a在减轻该转基因模型中观察到的加速衰老表型方面显示出优于NMN的疗效。

AEP裂解PP2A抑制剂SET。该裂解使PP2A过度激活，导致转录因子EB（TFEB）去磷酸化和去稳定。这破坏了溶酶体生物发生和自噬通量，这两个过程对细胞再生和受损蛋白及细胞器的清除至关重要。通过裂解SET并破坏TFEB功能，AEP直接损害自噬和溶酶体功能。这导致细胞碎片、功能障碍的线粒体和聚集蛋白的积累，这是衰老细胞的标志。因此，治疗性靶向AEP可能代表对抗衰老及其相关病理的一种新颖且有前景的策略。

肾脏衰老与分子和生理变化相关，导致肾功能丧失和再生潜力下降。AEP在肾小管中高表达，并且随着年龄增长显著下调。值得注意的是，小管特异性AEP敲除小鼠从第3个月开始出现自发性肾间质纤维化。在小管特异性AEP敲除小鼠和培养的AEP敲低HK-2细胞中，AEP缺乏诱导小管衰老激活，从而增加促纤维化衰老相关细胞因子的分泌，进而加速成纤维细胞激活。阻断衰老可减轻AEP缺乏引起的纤维化病变。显著的是，沉默AEP导致溶酶体pH值升高、溶酶体体积增大以及溶酶体电压依赖性膜通道蛋白增加。AEP下调诱导核TFEB激活，伴随线粒体自噬受损和线粒体活性氧（mtROS）积累增加。与这些观察结果一致，AEP通过裂解filin-1调节细胞骨架动力学来保护足细胞免受损伤。AEP在糖尿病肾小球和高糖刺激处理的足细胞中高度上调；然而，AEP基因敲除及其抑制剂处理加速链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠的糖尿病肾病（DN），而肾小球细胞中AEP的特异性诱导减轻足细胞损伤和肾功能恶化。这些观察结果表明AEP的生理作用是组织和疾病语境依赖性的，并强调了对AEP进行慢性抑制时需要仔细评估耐受性的必要性。在本研究中，全血细胞计数分析未显示在所评估时间窗口内所评估的全身指标存在主要异常（表S1），尽管这些数据并不能确立超出当前研究时长的长期安全性。这些结果与既往报告一致，即部分降低AEP活性可以耐受而不产生明显表型。治疗性NAD+增强也表现出对线粒体功能和年龄相关下降的修复作用。

我们在衰老队列中观察到一个引人注目的现象是，雌性和雄性小鼠在对照和#11a处理组中雌性寿命均较短，尽管该抑制剂显著延长了两种性别的寿命。这一趋势与许多研究中报告的雌性C57BL/6小鼠寿命较长这一常见发现相反，但并非没有先例。寿命中性别差异的表现可以强烈取决于病原体负担、饲养条件以及群体内自发性病理谱。在某些老龄化的C57BL/6群体中，雌性小鼠表现出更高的致死性疾病发生率，如溃疡性皮炎，这可以显著缩短其中位寿命，使之低于雄性。此外，生殖史是一个关键的且常被忽视的决定因素。与处女雌性不同，经历了反复怀孕和哺乳周期的雌性经历显著的生理应激和代谢成本，这可能导致加速衰老和寿命缩短。我们队列在18月龄时获取的具体预实验史因此可能有助于所观察到的性别差异。

FI数据显示，#11a在不同性别中改善了不同的病理特征集合（图1E和1F），进一步支持了这一观点，即在本队列中，衰老和死亡的潜在驱动因素在雄性和雌性之间可能存在差异。从机制上讲，这些性别二态性反应可能反映了激素调节和炎症环境方面的差异。性激素，包括雌激素，已被认为与线粒体功能、NAD+代谢以及SIRT1相关通路有关，而这些通路与AEP抑制所调节的NAMPT/NAD+/SIRT1轴密切相关。与此同时，雌性通常表现出更强的免疫和SASP相关炎症反应，涉及NF-κB和C/EBPβ信号通路，这可能改变其对针对C/EBPβ/AEP轴干预措施的敏感性。此外，性别依赖性的代谢应激、线粒体稳态和溶酶体功能差异可能进一步影响AEP的激活和下游治疗效果。总之，我们的工作表明，通过#11a抑制AEP与改善代谢和衰弱相关结局以及延长寿命和健康寿命有关。

研究的局限性

本研究存在几个局限性。首先，食物摄入量是在笼水平进行测量的。尽管平衡期1至5个月的确认性分析未发现显著的治疗效应，但#11a处理组的笼子内食物摄入量在几个时间点较低。有限的笼子数量无法排除食物摄入量变化对观察到的表型的贡献。此外，笼水平的食物摄入记录无法可靠地与个体纵向衰弱、生存、GTT或ITT结果相关联；因此，无法进行有效的个体水平食物摄入调整分析。前瞻性设计的配对喂养研究将有助于区分#11a的直接药理作用与食物摄入量相关效应。其次，雄性和雌性小鼠均被使用。除另有说明外，雄性和雌性小鼠在统计分析中被合并，且性别未被纳入主要模型的独立因素。本研究未进行足够统计效力以检测所有终点的性别特异性效应。虽然图1E和1F中呈现了性别特异性衰弱数据，但不能排除#11a对其他结局的潜在性别依赖性效应。未来具有足够统计效力的研究应将性别作为生物变量进行评估。第三，HT22细胞未由供应商标注性别；因此，无法评估该细胞模型中的性别相关效应。C2C12细胞为雌性来源。第四，尽管我们的分子发现与AEP-NAMPT-NAD+/SIRT1通路的调节一致，但在自然衰老小鼠中机制证据仍然主要是相关性的，并不能建立该通路的必要性。我们纳入了CD38 NAD酶活性和PAR基化等作为替代NAD+消耗通路的功能读数；然而，未来使用NAMPT遗传操作和更广泛的NAD代谢组学（如NMN、NR、烟酰胺）的研究将正式建立该通路的必要性。第五，体外模型捕捉了应激和衰老相关反应，但在所有测试条件下并不能完全定义完整的衰老程序。最后，多个组织水平分析和耐受性评估范围有限，未来研究需要更广泛的定量病理学以及更全面的长期安全性评估。

资源可用性

首席联系人

有关进一步信息和资源和试剂的请求应直接提交给首席联系人叶克强，并由其处理（[e-mail]）。

材料可用性

本研究使用的AEP抑制剂#11a可应首席联系人请求获得。

数据和代码可用性

• 本论文中报告的所有数据将应请求由首席联系人共享。

• 本研究未生成原始代码。

• 重新分析本论文中报告的数据所需的任何额外信息可应请求从首席联系人处获得。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（82394431）、国家重点研发计划（2023YFC3605400）、深圳市科技计划项目（KQTD20221101093608028）以及深圳市智能医学研究项目（B2404001）的资助。

作者贡献

K.Y.构思并监督了本研究。M.Y.、X.M.、Z.X.、M.W.和Z.Q.负责研究设计的所有方面。M.Y.和X.M.进行了实验、解释结果并执行统计分析。K.Y.、M.Y.和X.M.撰写了论文。M.Y.、X.M.、Z.X.、M.W.和Z.Q.验证了底层数据。所有作者均对论文进行了批判性审阅并批准了最终版本。

利益声明

K.Y.是与AEP抑制剂相关的专利申请中的发明人。

方法

关键资源表

试剂或资源 | 来源 | 标识符

**抗体**

Legumain (D6S4H) 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | Cat# 93627; RRID: AB_2800205

小鼠Legumain/天冬酰胺内肽酶抗体 | R&D | Cat# AF2058; RRID: AB_2234536

Alpha SMA抗体 | Affinity Biosciences | Cat# BF9212; RRID: AB_2839428

APP NME | MERSK | Cat# MAB348; RRID: AB_2056583

APP N585 | 叶实验室 | N/A

Tau 5 | Thermo Fisher | Cat# AHB0042; RRID: AB_2536235

Tau N368 | 叶实验室 | N/A; N/A

重组抗GAPDH抗体（兔mAb） | Servicebio | Cat# GB15004; RRID: AB_2943040

β-肌动蛋白单克隆抗体 | Thermo Fisher Scientific | Cat# MA1-140; RRID: AB_2536844

C/EBP beta (LAP) 抗体 | Cell Signaling Technology | Cat# 3087; RRID: AB_2078052

C/EBP beta 抗体（H-7） | Santa Cruz | Cat# sc-7962; RRID: AB_626772

NAMPT/PBEF 单克隆抗体 | Proteintech | Cat# 66385-1-Ig; RRID: AB_2881761

NAMPT C137 | Transgene | N/A

SirT1 (1F3) 小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | Cat# 8469; RRID: AB_10999470

PGC-1 alpha (3G6) 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | Cat# 2178; RRID: AB_823600

p21 Cip1 抗体 | Affinity Biosciences | Cat# AF6290; RRID: AB_2827699

纯化小鼠抗p21 | BD | Cat# 556431; RRID: AB_396415

抗CDKN2A/p16INK4a | Abcam | Cat# ab189034; RRID: AB_2737282

p16INK4a 单克隆抗体（1D7D2） | Invitrogen | Cat# MA5-17054; RRID: AB_2538526

p53 (1C12) 小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | Cat# 2524; RRID: AB_331743

CD38 (E9F5A) 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | Cat# 68336; RRID: AB_3674060

PARP (46D11) 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | Cat# 9532; RRID: AB_659884

Lamin B1 抗体（B-10） | Santa Cruz | Cat# sc-374015; RRID: AB_10947408

抗PAR（Ab-1）小鼠mAb | Sigma Aldrich | Cat# AM80; RRID: AB_2155072

**化学品、肽和重组蛋白**

#11a | 叶实验室 | N/A

H2O2 | 上海凌丰化学试剂 | 7722-84-1

D-半乳糖 | MCE | HY-N0210

TRIzol TM 试剂 | Invitrogen | Cat# 15596018

C | DMSO | Thermo Fisher | 85190

Z-Ala-Ala-Asn-AMC | Bachem | 149697-16-5

CD38抑制剂1（78c） | MCE | HY-123999

Olaparib | MCE | HY-10162

N6-乙啶腺嘌呤二核苷酸（ε-NAD） | MCE | HY-137592

重组人CD38蛋白 | SinoBiological | 10818-H08H

**关键商业检测**

EnzyFluo? NAD/NADH检测试剂盒 | BioAssay Systems | EFND-100

衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Cell Signaling Technology | #9860

Pierce? BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher | 23225

小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M3063

小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0037

小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0044

**实验模型：细胞系**

HT22 | CCTCC | SCSP-5419

C2C12 | CCTCC | SCSP-505

**实验模型：生物体/品系**

C57BL/6 | 维通生物有限公司 | N/A

**寡核苷酸**

Adrb3-正向 | Sangon | CTTGCCTCTCCATTCCTGACATC

Adrb3-反向 | Sangon | ATTCCGCACGACACACTTCACC

Adipoq-正向 | Sangon | TCTGCCTCAGTTTCTCTCGGCT

Adipoq-反向 | Sangon | GTAATAGAGCCAGGGAACGAAGC

Leptin-正向 | Sangon | GCAGTGCCTATCCAGAAGTCC

Leptin-反向 | Sangon | GGAATGAAGTCCAAGCCAGTGAC

Glut4-正向 | Sangon | TTCCTGTGGAGCCTTGTCACC

Glut4-反向 | Sangon | CTCCACCTTCTGTCTCTGCTCA

Insr-正向 | Sangon | AGATGAGGTGCAGTGTGGCT

Insr-反向 | Sangon | GGTTCCTTTGGCTCTTGCCAC

Fh1-正向 | Sangon | GAACTCACACGCAGGATGCTGT

Fh1-反向 | Sangon | GCGGCTTTTATTCTCACCATC

Pparg-正向 | Sangon | GTACTGTCGGTTTCAGAAGTGC

Pparg-反向 | Sangon | ATCTCCGCCAACAGCTTCTCCT

Pgc1α-正向 | Sangon | GAATCAAGCCACTACAGACACCG

Pgc1α-反向 | Sangon | CATCCCTCTTGAGCCTTTCGTG

Ucp1-正向 | Sangon | GCTTTGCCTCACTCAGGATTGG

Ucp1-反向 | Sangon | CCAATGAACACTGCCACACCTC

Dio2-正向 | Sangon | GGTGGTCAACTTTGGTTCAGC

Dio2-反向 | Sangon | AAGTCAGCCACCGAGGAGAACT

p21-正向 | Sangon | TCGCTGTCTTGCACTCTGGTGT

p21-反向 | Sangon | CCAATCTGCGCTTGGAGTGATAG

p16-正向 | Sangon | TGTTGAGGCTAGAGAGGATCTTG

p16-反向 | Sangon | CGAATCTGCACCGTAGTTGAGC

Tnfα-正向 | Sangon | GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT

Tnfα-反向 | Sangon | GCCATAGAACTGATGAGAGGGAG

Il1b-正向 | Sangon | TGGACCTTCCAGGATGAGGACA

Il1b-反向 | Sangon | GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG

Il6-正向 | Sangon | TACCACTTCACAAGTCGGAGGC

Il6-反向 | Sangon | CTGCAAGTGCATCATCGTTGTT

Gapdh-正向 | Sangon | CATCACTGCCACCCAGAAGACTG

Gapdh-反向 | Sangon | ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG

**软件和算法**

Prism 10 | Graphpad | https://www.graphpad.com/

EthoVision XT 17 | Noldus | N/A

**实验模型和研究参与者细节**

**小鼠**

野生型C57BL/6小鼠购自维通生物有限公司（南京，中国）。小鼠在约18月龄时开始研究；在23月龄时进行中间表型分析和组织收集。所有小鼠饲养在12小时明暗周期下，温度保持在20至22°C之间。所有动物操作均经中国科学院深圳先进技术研究院（SIAT）机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（批准编号：SIAT-IACUC-20220407-SLG(C)-SMJKXY-YKQ-A2096-01），所有实验均符合AAALAC国际指南及相关国家和机构法规标准。雄性和雌性C57BL/6小鼠均被使用。除另有说明外，雄性和雌性小鼠在统计分析中被合并。性别未被纳入主要分析的独立因素，且本研究未进行足够统计效力以检测所有终点的性别特异性效应。性别特异性衰弱数据在图1E和1F中呈现，性别相关差异在结果和讨论部分进行描述。评估性别作为独立变量的有限统计效力被确认为一项局限性。

**细胞系**

HT22小鼠海马神经元细胞（供应商未指定性别）和C2C12小鼠成肌细胞（雌性）在含10%胎牛血清（FBS，Gibco，10270106）和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良鹰氏培养基（DMEM，Sigma-Aldrich，D7777）中培养，在37°C、5% CO2的湿润气氛下培养。为诱导衰老，HT22细胞用100 μM H2O2处理2小时。去除培养基并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，细胞在含500 nM #11a的DMEM中孵育24小时，从而评估#11a对细胞衰老的影响。C2C12细胞用20 mg/mL D-半乳糖处理3天。#11a稀释在含D-半乳糖的DMSO中。将500 nM #11a添加到衰老C2C12细胞中24小时，从而评估#11a对细胞衰老的影响。为进行抗PAR免疫印迹验证，HT22细胞用500 μM H2O2单独处理（作为阳性对照）或先用10 μM olaparib（MCE，HY-10162）预处理30分钟再用500 μM H2O2处理30分钟，以确认在免疫印迹条件下检测到PAR拖尾信号。本研究使用的细胞系购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC，武汉，中国），并在接收后的有限低传代范围内使用。两个细胞系均未列在ICLAC常见错误鉴定细胞系登记表中。细胞系未在我实验室进行独立鉴定。未检测支原体污染。

**方法细节**

**实验组和#11a给药**

所有寿命和健康寿命实验在约18月龄时开始。自然衰老队列包括雌性和雄性C57BL/6小鼠。健康寿命和生存分析同步启动。#11a以0.056 g/kg饲料的剂量通过饮食连续给药。基于每只约30克体重的小鼠平均每日食物摄入量约4克，估算每日暴露量约为7.5 mg/kg体重/天。小鼠随机分配至对照组（标准饮食，LAD-3001M）或#11a补充饮食组（每组n = 26）。所有小鼠在约18月龄时被分配至对照饮食组或#11a补充饮食组。每组预定子集动物在处理五个月后（23月龄）被安乐死，用于中间表型分析和组织收集。剩余动物在相同处理条件下继续用于纵向寿命和衰弱评估。为计划中间组织收集而移除的动物未被计入生存分析中的自发死亡。

**随机化和盲法**

小鼠在研究开始时随机分配至对照组或#11a处理组。寿命监测在整个研究期间持续进行。衰弱指数评分、行为评估、组织学分析和图像定量在可行的情况下由对治疗分配设盲的研究人员执行。数据在组别揭盲前使用编码样本进行分析。

**寿命和衰弱评估**

**小鼠寿命分析**

小鼠寿命如先前描述进行监测。寿命研究的主要结局为总体生存率，记录死亡年龄（对于自发死亡或达到预设终点标准后有人道安乐死的小鼠）。安乐死仅在兽医根据AAALAC国际指南独立评估，小鼠符合IACUC批准的人道终点标准，且被认为不太可能存活超过未来48小时且无显著不适时进行。人道终点标准包括严重嗜睡、体重快速下降（两周超过20%）、严重腹部膨大、带有疼痛体征的身体状况评分（如面露痛苦表情）、对外部刺激无反应、严重溃疡或出血性肿瘤，以及伴有异常呼吸率的明显低体温症。体重每两周记录一次。食物摄入量每月在笼水平评估；每个笼子每时间点进行三次重复测量并取平均值，生成一个笼水平值。

**衰弱评估**

衰弱评估使用经过验证的非侵入性临床衰弱指数，如先前描述。对于评估的主观特性，所有测量均为完全盲法。这些评估表明年龄相关的健康衰退，包括评估动物骨骼肌肉系统、前庭耳蜗/听觉系统、眼鼻系统、消化系统、泌尿生殖系统、呼吸系统、不适体征和体重。0分表示无衰弱体征和给定特征的完全健康；中度表型评分为0.5，重度表型评分为1。为评估#11a对健康寿命的影响，衰弱指数评分从18月龄开始每月记录一次，并在整个寿命期间比较#11a喂养组与对照组。

**神经肌肉功能和运动协调性评估**

**跑步机测试**

对于衰竭测试，小鼠接受渐进式跑步机跑步方案。测试以5 m/min的速度开始3分钟，随后以2 m/min的速率递增速度，直至达到15 m/min。记录每只小鼠的跑步时间和速度，直到耗竭，定义为无法维持跑步并从跑步机上掉下。对于耐力测试，小鼠以15 m/min的恒定速度跑步。跑步持续时间记录方式如上所述，直到小鼠达到失败。

**悬线测试**

前肢抓握力和神经肌肉功能使用悬线测试评估。每只小鼠被轻轻提起尾根，并用两只前爪和后爪抓住不锈钢网格。然后网格倒置，记录掉落延迟时间。每只小鼠进行三次连续试验，使用试验中达到的最大悬挂时间进行分析。

**认知功能评估**

**开放场测试**

运动活动和焦虑样行为使用开放场测试评估。开放场箱体由一个方形白色箱体（40 cm × 40 cm × 40 cm）组成。

每只小鼠单独放置于圆形活动场中央，允许其自由探索5分钟。利用视频追踪软件（EthoVision，Noldus Information Technology）记录并分析总移动距离以及在中区和外区停留的时间。

**新物体识别测试**

新物体识别测试用于评估识别记忆。在熟悉阶段，将小鼠置于测试场中5分钟，场中相对象限各放置一个相同的物体。经过1小时的间歇期后，将一个物体替换为新奇物体，并允许小鼠自由探索两个物体5分钟。探索行为定义为对物体的直接嗅闻或触碰。利用视频追踪软件（EthoVision，Noldus Information Technology）记录行为。辨别指数计算公式为：探索新奇物体的时间除以探索两个物体的总时间。

**Y型迷宫**

利用具有三个相同臂的Y型迷宫评估空间工作记忆。在训练阶段，将每只小鼠放置于起始臂并面向墙壁，仅允许其进入两个臂10分钟，第三个（新奇）臂被封闭。每只小鼠之间均清洁迷宫以消除气味线索。训练后，将小鼠送回原笼。1小时后，将小鼠重新放置于起始臂，允许其探索所有三个臂5分钟。利用追踪软件（EthoVision XT，Noldus Information Technology）量化每个臂的进入次数和停留时间。

**腹腔葡萄糖和胰岛素耐量试验（IPGTT和IPITT）**

分别通过腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）和腹腔胰岛素耐量试验（IPITT）评估葡萄糖稳态和胰岛素敏感性。注射后，利用血糖仪（ROCHE ACCU-CHEKTM）在指定时间点测量血糖水平。对于IPGTT，小鼠禁食12小时，随后腹腔注射无菌葡萄糖溶液，剂量为2 g/kg体重。对于IPITT，小鼠禁食6小时，随后腹腔注射人胰岛素，剂量为0.5 U/kg体重。注射前（0分钟）及随后指定时间点通过尾静脉采集血液，使用Roche Accu-Chek血糖仪测量血糖水平。

**样本采集**

经过五个月治疗后，在深度异氟烷麻醉下（5%诱导、2%维持）通过心脏穿刺人道处死小鼠。全血采集于EDTA抗凝管中，并在4°C下以2,000 × g离心10分钟以分离血浆。灌注使用蠕动泵系统进行，经过少量改良。以5 mL/min的流速灌注约20-30 mL PBS，直至右心房的流出液变清、肝脏变苍白，表明血液已完全清除。迅速解剖主要器官，包括大脑、肝脏和股四头肌。用于分子分析的组织在液氮中速冻并储存在-80°C以备后续分析。用于组织病理学检查的样本在4°C下浸入4%多聚甲醛（PFA）固定48小时，随后转移至75%乙醇中长期保存。

**LC-MS/MS定量**

利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS；SHIMADZU 8050）定量血浆中#11a的浓度。样本通过甲醇进行蛋白沉淀处理。每个分析批次均新鲜配制校准标准品。基于分析物与内标峰的峰面积比，在0.1-500 ng/mL浓度范围内建立线性校准曲线。

**生化与分子分析**

**Western blot分析**

将细胞和组织用冰冷的PBS洗涤，在冰上使用WB裂解液（Yeasen，20118ES60）裂解30分钟，并添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。裂解液在4°C下以15,000 × g离心15分钟。收集上清液，与含有5% β-巯基乙醇的SDS上样缓冲液混合，煮沸5分钟使蛋白变性。通过SDS-PAGE分离蛋白后，转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜用含5%脱脂牛奶的TBST（含Tween 20的Tris缓冲盐溶液）在室温下封闭1小时，然后在4°C下与特异性一抗孵育过夜。孵育后，膜经洗涤并在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育1小时。用TBST彻底洗涤后，利用增强化学发光（ECL）检测系统显影蛋白条带。

**实时定量PCR分析**

使用TRIzol试剂（Invitrogen，15596018CN）从细胞和组织中分离总mRNA。使用一管法RT-gDNA消化SuperMix（Yeasen，11142ES60）以1 μg总RNA进行cDNA合成。按照制造商说明，在QuantStudio 3系统（Applied Biosystems，美国）上使用SYBR Green Master Mix（Yeasen，11185ES03）进行定量PCR扩增。通过2^ΔΔCt方法，以Gapdh作为内参基因，计算相对mRNA表达水平。

**酶联免疫吸附测定（ELISA）**

按照制造商方案，使用相应的商品化ELISA试剂盒（Cloud-Clone Corp）测定血浆中胰岛素、FSH、LH、雌二醇和睾酮的水平。从禁食小鼠中采集血样，以3000 rpm离心15分钟获得血清。血浆样本在分析前用提供的样本稀释液按1:10稀释。使用酶标仪（BioTek，Synergy H1，美国）在450 nm处测量吸光度，并基于标准曲线确定样本浓度，以ng/mL表示。

TNF-α、IL-1β和IL-6的水平使用相应的商品化ELISA试剂盒（Elabscience）按照制造商方案测定。组织在同一时间采集，在4°C下以5,000 rpm离心10分钟，收集上清液。样本在分析前用提供的样本稀释液稀释。使用酶标仪（BioTek，Synergy H1，美国）在450 nm处测量吸光度，并基于标准曲线确定样本浓度。

**免疫荧光**

组织样本在4°C下用4% PFA固定24-48小时。固定后，组织经梯度乙醇系列处理、石蜡包埋并以4 μm厚度切片进行组织学分析。或者，对于冷冻切片，组织用最优切片温度（OCT）复合物包埋、速冻并以10 μm厚度切片。切片用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时，然后在4°C下与一抗孵育过夜。室温下应用Alexa Fluor标记的二抗1小时。细胞核用DAPI复染。盖玻片封片至载玻片上，使用共聚焦显微镜（LSM 980，Zeiss）成像。利用ImageJ软件量化荧光密度，各组平均荧光强度的比值用于绘制直方图。

**Masson三色染色**

组织样本在Bouin固定液（Sigma，#HT10132）中固定24小时，石蜡包埋并以4 μm厚度切片。切片按以下顺序进行染色：Weigert苏木素（Sigma，#HT1079）5分钟、Biebrich猩红-酸性品红（Sigma，#B5393）10分钟、磷钼酸（Sigma，#P7960）10分钟、苯胺蓝（Sigma，#415049）5分钟。随后在1%乙酸中分化。利用ImageJ软件以蓝色染色面积百分比量化胶原沉积。蓝色面积百分比计算为苯胺蓝阳性像素数除以组织总像素数，每个切片至少分析10个随机20×视野。

**显微计算机断层扫描（μCT）**

股骨离体后使用显微CT系统（NMC-200，NEMO，中国）进行扫描，各向同性分辨率为12 μm，工作参数为60 kV和120 μA，配备0.5 mm铝滤波器。数据采集使用Cruiser软件。图像使用FDK算法（Recon软件）重建，并以校准阈值（790.2灰度单位，相当于360 mg HA/cm3）进行分割。松质骨在距生长板近端0.6 mm处、1.68 mm3的区域内进行分析；皮质骨在中骨干处进行评估。按照ASBMR指南计算松质骨微观结构（包括骨体积分数（BV/TV）、小梁厚度（Tb.Th）、小梁间距（Tb.Sp）、小梁数量（Tb.N））和皮质骨形态（包括皮质骨厚度（Ct.Th）、皮质骨面积（Ct.Ar））。三维渲染和分析使用Avatar软件（μCT Ray v4.0，Scanco Medical）生成。

**血液学和生化分析**

通过心脏穿刺采集全血，收集于EDTA抗凝管中（Servicebio，#QX0005）用于全血细胞计数（CBC），以及肝素化管中（Servicebio，#QX0015）用于血清生化检测。血液学参数在采集后2小时内使用全自动兽医血细胞分析仪（Mindray BC-5000vet，中国）在ServiceBio Co., Ltd.（中国武汉）进行测量。血清生化参数使用Chemray 800全自动生化分析仪（瑞托，中国）进行分析。质量控制通过每日使用商业标准品进行校准，批间变异系数保持在5%以下。

**衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性**

按照制造商说明，使用衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒（Cell Signaling Technology，#9860）检测SA-β-Gal染色。SA-β-Gal阳性细胞以占总细胞数的百分比进行量化。

**AEP活性测定**

组织匀浆在200 μl测定缓冲液（20 mM柠檬酸、60 mM Na?HPO?、1 mM EDTA、0.1% CHAPS和1 mM二硫苏糖醇，pH 6.0）中孵育，含有20 μM δ分泌酶底物Z-Ala-Ala-Asn-AMC（Bachem）。通过测定荧光在460 nm发射波长处的动力学变化，量化底物裂解后释放的荧光AMC，使用37°C恒温维持的酶标仪进行测量。

**CD38 NAD酶活性测定**

CD38 NAD酶活性测定方法如前所述，经过少量改良。冷冻组织样本（约20 mg）在300 μL冰蔗糖缓冲液（0.25 M蔗糖、40 mM Tris，pH 7.4）中匀浆，短暂超声处理，并在4°C下以14,000 × g离心10分钟。使用BCA法测定上清液中蛋白浓度，每个反应使用等量蛋白。加入ε-NAD（最终浓度50 μM）启动反应。每37°C下每分钟测量一次荧光，持续1小时（激发波长360 nm；发射波长460 nm）。NAD酶活性从荧光-时间曲线线性部分的斜率计算，经背景扣除后按蛋白含量标准化。重组人CD38（Sino Biological，Cat. 10818-H08H）和78c（50 nM）分别用作阳性对照和抑制对照。

**NAD?/NADH测定**

按照制造商说明，使用NAD?/NADH检测试剂盒（EnzyFluo?，EFND-100）测定大脑、股四头肌、肝脏和肾脏匀浆中NAD?和NADH的水平。样本在室温下于96孔板中混合。使用酶标仪在λ_ex/em = 530/585 nm处定量总NADH和NAD?。

**定量与统计分析**

统计分析使用GraphPad Prism 10.1.2软件进行。所有实验独立重复至少三次，并进行盲法定量。数据以均值±SEM或均值±SD表示（如图注所示），n代表生物学重复。除特别说明外，两组间显著性采用非配对双尾Student's t检验，三组或以上采用单因素ANOVA后接Bonferroni多重比较检验，不符合正态分布假设时采用Mann-Whitney U检验。Kaplan-Meier生存曲线采用对数秩检验进行比较。风险比和95%置信区间采用Mantel-Haenszel法估算。纵向虚弱指数数据采用线性混合效应模型分析，以小鼠编号为随机效应，治疗和时间为固定效应；使用卡方检验将模型拟合度与简单ANOVA模型进行比较。治疗1-5个月后的食物摄入数据采用双因素重复测量ANOVA分析，以治疗为笼间因素、时间为笼内因素、笼为重复实验单元。应用Greenhouse-Geisser校正和Sidak校正事后比较。6-9个月的数据未纳入确认性分析，因为在计划的中期组织采集和随后的自然淘汰后，笼位可用性下降。细胞实验独立重复至少三次。在尽可能可行的情况下，研究人员对虚弱评分、行为评估、组织病理学分析和图像量化进行了治疗分组的盲法处理。显著性定义为p < 0.05。星号表示?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001。

**补充信息** (1) PDF (1.45 MB) 文档S1：图S1-S6、表S1和数据S1