基于新型抗聚糖单克隆抗体的哺乳动物脑及脑肿瘤区域特异性岩藻糖化与唾液酸化聚糖表达图谱

《iScience》：Regio-specific glycan expression within the mammalian brain and tumors

　　

哺乳动物脑呈现复杂的聚糖密码（glycan code），协调神经连接性；然而，糖蛋白上功能性关键修饰如岩藻糖化（fucosylation）和唾液酸化（sialylation）的空间组织仍不清楚。研究人员利用为聚糖检测设计的新型单克隆抗体（mAbs），以空前的灵敏度绘制聚糖表位的表达，揭示非重叠表达模式。结合靶向N-/O-聚糖谱分析，研究人员发现岩藻糖化和唾液酸化聚糖在小鼠和人中枢神经系统（CNS）中表达于解剖学上不同的区域。关键发现包括：岩藻糖化O-聚糖标记脑内皮细胞，唾液酸化O-聚糖修饰郎飞结（nodes of Ranvier）处的lecticans，而副嗅球含有独特的岩藻糖化N-聚糖。RNA测序（RNAseq）和共定位研究证实区域特异性糖基转移酶（glycosyltransferase）活性驱动这种分区。研究人员还发现，与正常组织相比，脑肿瘤以特定岩藻糖化/唾液酸化表位上调表达为特征。基于mAb的方法揭示区域特异性聚糖表达，对神经发育和癌症诊断具有重要意义。

研究背景与问题：蛋白糖基化（protein glycosylation）在中枢神经系统（CNS）发育、神经细胞相互作用和生理功能中至关重要；先天性糖基化障碍（CDGs）可导致神经元发育病理并与严重神经精神障碍相关。然而，脑内多种糖蛋白上聚糖展示仍不清楚，且免疫组织学水平缺乏识别特定聚糖结构的明确试剂，使聚糖定位及其病理改变存在不确定性。末端岩藻糖化形成的H抗原（Fucα1-2Galβ1-R）与突触可塑性、学习和记忆相关；唾液酸（Neu5Ac）α2-6或α2-3连接是另一关键末端修饰，但SNA凝集素特异性有限。为此，研究人员开发新型重组mAb，并结合靶向糖组学、免疫组化和转录组，以绘制区域特异性聚糖图谱并比较人脑肿瘤。

研究人员利用mAb O1（H抗原）、mAb O2（Neu5Acα2-6）、mAb O3（H II型抗原，Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc-R），结合靶向N-/O-聚糖谱、免疫荧光/免疫组化、酶处理、共定位、RNAseq和公共数据库，以及人正常脑组织和脑肿瘤组织芯片，发现岩藻糖化和唾液酸化聚糖在鼠和人CNS中呈区域分离、非重叠表达，并在脑肿瘤中异常表达。该研究为神经发育和癌症诊断提供了工具与资源。

关键技术方法：研究人员从免疫海七鳃鳗（Petromyzon marinus）的VLRB酵母展示库筛选抗聚糖mAb（O1、O2、O3）并重组表达为Ig嵌合体；对C57/BL6小鼠微解剖脑区进行靶向LC-MS/MS N-/O-聚糖谱分析；用免疫荧光和免疫组化、PNGaseF/神经氨酸酶/FucosEXO处理、Western blot和共定位验证表位及载体；结合braincelldata.org单细胞/单核RNA-seq与Allen Brain Atlas转录组；在人正常脑组织芯片BNC17011d和脑肿瘤/正常组织芯片GL1201（TissueArray.com）上免疫组化。

研究结果：
脑区特异性糖基化谱的质谱分析显示α2,6-唾液酸化主要位于O-聚糖，而H抗原不普遍。通过LC-MS/MS分析小鼠多个脑区N-/O-聚糖，发现N-聚糖以寡甘露糖如Man₅GlcNAc₂-Asn及岩藻糖化/平分型结构为主，Neu5Acα2-6在N-聚糖低水平；O-聚糖广泛含唾液酸，Neu5Acα2-6显著，而H抗原低于质谱检测阈值。结论：质谱提示α2-6唾液酸在O-聚糖突出，低丰度H抗原需互补检测。

空间定位揭示末端岩藻糖和唾液酸在小鼠脑区呈明显且非重叠分布。通过mAb O1/O2/O3免疫荧光，O1染血管样结构、海马神经元、脉络丛及嗅球，O3主要染嗅球，O2在胼胝体、小脑活树、前连合等白质富集区强染而血管阴性。结论：岩藻糖化和唾液酸化表位具有区域和细胞类型特异的非重叠分布。

副嗅球独特富集携带H II型抗原的N-聚糖。通过mAb O3共聚焦、免疫印迹、PNGaseF与FucosEXO处理、单核RNA-seq及OMP/NCAM共定位，发现副嗅球（AOB）强染H II型，PNGaseF去除、FucosEXO去除O1/O3而UEA-I残留，FUT1（岩藻糖基转移酶1）在神经元等表达，H II型N-聚糖只见于AOB而不见于主嗅球且与神经细胞黏附分子（NCAM）共定位。结论：AOB富集H II型N-聚糖，NCAM为潜在载体。

脑内皮细胞携带H抗原的O-聚糖。通过mAb O1血管染色、CD31⁺内皮细胞分离与免疫印迹、PNGaseF处理、Fut2单细胞数据和CD31共定位，发现H抗原见于静脉和毛细血管，CD31⁺细胞富集，PNGaseF后染色增加提示O-聚糖或PNGaseF不敏感N-聚糖，Fut2主要在内皮细胞。结论：脑内皮细胞表达H I型O-聚糖。

在白质和神经元结构中发现携带Neu5Acα2-6的O-聚糖。通过mAb O2共聚焦及PNGaseF/神经氨酸酶处理，发现O2点状染白质富集区、皮层海马神经元和脉络丛上皮；PNGaseF不消除而神经氨酸酶消除，SNA（Sambucus nigra凝集素）弥散且酶后残留；单核RNA-seq显示O-聚糖α2-6唾液酸转移酶St6GalNAc1/4等高于St6Gal1/2，St6GalNAc3在少突胶质细胞高表达。结论：Neu5Acα2-6主要携带于O-聚糖并富集白质，与酶表达一致。

Neu5Acα2-6聚糖定位于神经周围网和郎飞结。通过mAb O2与CASPR（接触蛋白相关蛋白）、neurocan共定位，发现O2点状信号被CASPR旁侧界定，定位郎飞结（nodes of Ranvier），并与neurocan在神经周围网（PNNs）和结细胞外基质共定位。结论：首次显示Neu5Acα2-6修饰富集于PNN和郎飞结，lecticans（硫酸软骨素蛋白聚糖）为潜在载体。

免疫组化和转录组揭示哺乳动物脑保守的区域特异性聚糖表达。通过人正常脑组织芯片mAb O1/O2/O3染色及Allen Brain Atlas转录组，发现H II型在皮层、小脑、脊髓、视神经等血管化区域阳性率较高，O2在白质富集且血管阴性，FUT1/FUT2与ST6GAL1/2、ST6GALNAC4-6表达与表位分布相关。结论：鼠和人脑区域特异性糖基化保守，糖基转移酶表达支持分区。

人脑肿瘤异常聚糖表达显示肿瘤类型特异模式。通过120例脑肿瘤和10例正常组织芯片mAb O1/O2染色，发现H抗原在良恶性脑肿瘤升高，如颅咽管瘤、脑膜瘤、星形细胞瘤和胶质母细胞瘤，Neu5Acα2-6在多种肿瘤增强，如颅咽管瘤、弥漫B细胞淋巴瘤、星形细胞瘤和胶质母细胞瘤。结论：脑肿瘤具有肿瘤类型相关聚糖异常，提示诊断标志物潜力但需更多样本验证。

讨论总结：讨论指出mAb补充RNAseq和质谱，质谱可能漏检低丰度或PNGaseF不敏感聚糖；H II型在AOB与NCAM/FUT1相关，内皮H O-聚糖与糖萼和血脑屏障相关；Neu5Acα2-6 O-聚糖在PNN和郎飞结与lecticans相关；人脑肿瘤岩藻糖化和唾液酸化异常；鼠人存在差异如人内皮H II型高而鼠脑内皮细胞无、人皮层O2弥漫而鼠不明显。mAb可重组并用于血脑屏障研究。研究结论（据原文翻译）：这些结果揭示哺乳动物脑和肿瘤中岩藻糖化与唾液酸化聚糖的独特区域特异性表达；显示这些表位在脑内明显非重叠，其中岩藻糖化N-聚糖见于副嗅球、岩藻糖化O-聚糖见于脑内皮细胞、α2,6-连接唾液酸见于郎飞结。